甘蓝型油菜种皮木质素合成相关基因的差异表达分析

发布时间：2020-09-25 19:24

　　甘蓝型油菜(Brassica napus L.,2n=38,AACC)属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica),不仅是一种重要的油料作物,也是动物蛋白饲料的重要来源之一。木质素是一种高分子芳香族聚合物,是细胞壁的主要组分之一。然而,种皮中过量的木质素会降低菜籽饼粕的可利用性,制约菜籽饼粕的发展。为了减少油菜种皮的木质素含量,降低皮壳率,提高饼粕的饲用价值,本研究筛选了重组自交系的高木质素和低木质素材料进行研究,旨在探究造成甘蓝型油菜种皮木质素含量差异的原因,挖掘种皮木质素生物合成过程的关键调控因子,主要结论如下:1、甘蓝型油菜种皮高/低木质素极端材料的筛选通过分析连续两年172份甘蓝型油菜重组自交系材料籽粒的近红外扫描数据,筛选出高木质素材料(ADL含量为2.49%~4.70%)和低木质素材料(ADL含量为0.97%~1.34%)各五种材料。高木质素材料的籽粒表现为黑灰色(黄籽度为47.45~67.35);低木质素材料的籽粒表现为姜黄色(黄籽度为116.58~144.71)。2、甘蓝型油菜高/低木质素材料籽粒的性状分析高木质素材料籽粒的皮壳率为15.26%~18.76%,而低木质素材料为10.94%~12.26%,高木质素材料籽粒的皮壳率明显高于低木质素材料。高、低木质素材料的平均含油量分别为36.70%~40.99%、37.60%~42.63%;高、低木质素材料的平均蛋白质含量分别25.58%~28.25%、27.80%~30.89%,低木质素材料的含油量和蛋白质含量高于高木质素材料。3、甘蓝型油菜高/低木质素材料种皮的切片观察对高/低木质素材料成熟籽粒种皮切片进行显微观察。结果显示,高木质素材料籽粒的种皮比低木质素材料厚,尤其是栅栏层,说明木质素含量会影响种皮厚度。对开花后40 d和成熟籽粒冷冻切片进行间苯三酚染色,高木质素材料种皮的内皮层与栅栏层细胞壁被间苯三酚染成红色,染色不明显。4、高/低木质素材料的转录组分析将开花后35、40和46天(Days After Flowering,DAF)三个发育时期的种皮和种胚进行转录组测序。基于|log_2(fold change)|≥1,FDR0.01筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),共筛选到15030个DEGs。在GO富集分析中,上调和下调基因均富集到细胞、细胞器、转运活性和代谢过程等。经过TopGO分析,发现差异表达基因主要富集到细胞壁、次级代谢过程、肉桂酸生物合成过程、苯丙氨酸解氨酶活性等。接着,对差异表达基因进行KEGG代谢通路富集分析,发现差异表达基因主要富集到苯丙氨酸代谢、氨基酸生物合成、类黄酮生物合成等生物合成代谢过程。对苯丙烷-木质素-类黄酮途径DEGs进行聚类分析,大部分的相关基因在高木质素材料种皮中上调表达。位于上游的苯丙烷途径中,编码PAL、C4H和4CL三种酶的DEGs表达量较高;木质素合成的特异途径中,BnCCoAOMT和BnCOMT家族成员的表达量较高,推测在种皮中主要由G型和S型木质素组成。在种皮发育的35、40和46 DAF三个时期,BnPAL和BnC4H基因家族的全部成员在高木质素材料种皮中的表达量明显高于低木质素材料,Bn4CL基因家族的大部分成员也呈现此趋势。对PAL、C4H和4CL家族的差异表达基因所受调控的miRNA进行预测,bna-miR172c、bna-miR396a和bna-miR172b调控的基因数目最多。对PAL、C4H和4CL家族的差异表达基因进行互作蛋白的预测,发现BnC4H-4互作蛋白数目最多。编码赤霉素20-氧化酶3的BnGA20OX3上调表达,编码生长素相关蛋白的BnAuxin下调表达,编码茉莉酸羧基甲基转移酶的BnJMT上调表达,可能是造成甘蓝型油菜种皮高/低木质素含量差异的原因。8个编码NAC转录因子的DEGs在高木质素材料种皮发育的3个时期,均上调表达,其中BnNAC080和BnNAC083差异倍数较大,BnMYB9、BnMYB9-1、BnMYB60和BnMYB60-1上调表达,BnMYB91下调表达,可能调控木质素合成途径下游的结构基因。对筛选出的23个关键基因进行qRT-PCR,与转录组测序结果一致。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.4
【部分图文】：

生物合成途径,木质素,辅酶

图 1.1 木质素生物合成途径 (Vanholme et al., 2010)Fig. 1.1 A Scheme of Lignin Biosynthesis (Vanholme et al., 2010)phenylalanine ammonia-lyase, PAL），肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase, C4H），4 ligase, 4CL），莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转化酶（hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate tracoumarate 3-hydroxylase, C3H），5-羟基阿魏酰辅酶A-O-甲基转移酶（caffeoyl-CoA-O-m辅酶A还原酶（cinnamoyl CoA reductase, CCR），阿魏酸-5-羟化酶（ferulate 5-hydroxylase, F5移酶（caffeic acid O-methyltransferase, COMT），肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogense, PER），LAC：漆酶（Laccase, LAC）。一种 P450 细胞色素酶，催化香豆酰辅酶 A 羟基化形成咖啡 2002)。香豆酰辅酶 A 是一个分支，在此分为两个方向，一 H 型木质素，另一个由 C3H/HCT 催化进行一系列的反应。Ralph 等(2012)将杨树 C3H 的表达水平降低，发现木质素显著增加了 H 型木质素的含量。HCT 处于 C3H 羟基化反化完成香豆酰辅酶 A 到咖啡酰辅酶 A 的转化。在拟南芥中 HCT 基因沉默，发现基因沉默导致植株矮化表型和木质素，则表现为苯丙素的减少和木质素含量的下降，特别是 S

木质素,种皮颜色,甘蓝型油菜,含油量

图 4.1 甘蓝型油菜高/低木质素的成熟种子种皮颜色观察Fig. 4.1 The color of mature seeds coat with (A) H- and (B) L-lignin注：（A）高木质素；（B）低木质素。标尺，2 mm。Note: (A) High-Lignin. (B) Low-Lignin. Bar, 2mm.4.2 高/低木质素材料种子性状分析对筛选出的高/低木质素含量的材料进行种子品质性状分析，2014 年高、低木质素材料的平均含油量分别为 36.70%、37.60%，2015 年高、低木质素材料的平均含油量分别为 40.99%、42.63%。2014 年高、低木质素材料的平均蛋白质含量分别28.25%、30.89%，2015 年高、低木质素材料的平均蛋白质含量分别为 25.58%、27.80%（表 4.2）。表 4.2 甘蓝型油菜种子高/低木质素籽粒的品质性状分析Table 4.2 Analysis of quality traits of H/L-lignin seeds in Brassica napus L.2014 年 2015 年重组自交系编号RIL ID含油量（%）Fat蛋白质含量（%）Protein黄籽 R 值Degree ofyellow-seeded含油量（%）Fat蛋白质含量（%）Protein黄籽 R 值Degree ofyellow-seededRIL436.3027.4647.4539.0125.7955.44

千粒重,材料,皮壳,木质素

图 4.2 极端材料千粒重的统计ical analysis of the 1000-grain weight of ex表存在 1%和 5%水平上的差异，即 P<0.01 和 P <0.05。letters represent significance (α) at 0.05 and 0.01, respective料种子皮壳率分析质素含量是否对籽粒的皮壳率有影质素材料 RIL14、RIL162 和 P174，其皮壳率。高木质素材料籽粒的皮94%~12.26%（图 4.3），高木质素材.3），因此我们推测高木质素籽粒的

【参考文献】