NtBRI1及相关基因在烟草花发育响应苗期低温诱导过程中的功能研究

发布时间：2020-09-27 19:57

　　烟草(Nicotiana tabacum L.)是重要的叶用型经济作物,叶片生长发育直接影响其经济价值。山地烤烟种植因立体气候,海拔较高地区的烟株易在苗期经历较长时间的低温,导致烟草早花。早花与花芽的提前分化有关,烟株提前结束营养生长,使叶数、叶片质量和品质最终达不到生产上要求。在前期研究中,通过基因表达谱筛选和分析,将BR信号通路与烟草早花紧密的联系了起来。为了研究BR信号通路与烟草早花的具体联系,已用基因编辑技术得到了BR信号受体NtBRI1基因的突变体植株B-2,为后续实验提供材料。本实验在前人研究的基础上,构建了NtBRI1过表达载体,培育出了NtBRI1过表达转基因植株NtBRI1-OE,并对B-2突变体和NtBRI1-OE转基因植株进行了不同温度的处理。通过对处理前后农艺性状相关表型和基因相对表达量的观察、检测和分析,所得结论如下:(1)根据普通烟草NtBRI1基因CDS序列设计引物,成功克隆出了NtBRI1基因序列,测序后与中国烟草基因组数据库中普通烟草的NtBRI1基因一致性达到99.8%。利用克隆出的序列成功构建了pC2301M1DPB-NtBRI1过表达载体,并通过农杆菌侵染法转入植物叶片,组织培养之后经过GUS染色、PCR鉴定和除草剂Basta鉴定等方法得到了NtBRI1-OE转基因植株。(2)将6叶期NtBRI1-OE植株和WT野生型植株进行不同温度处理后,对相关性状、基因表达量进行观察和检测,结果表明:常温下NtBRI1-OE过表达植株现蕾时间比野生型植株提前了16天,出现了明显的早花现象,而其与低温处理的表型差异不大,说明植株过表达NtBRI1基因后产生了与低温处理相似的效应。基因相对表达量的检测也表明NtBRI1基因的过量表达最终使转基因植株的NtFLC和NtLFY基因与野生型产生了表达差异,这可能是导致植株现蕾期提前的关键因素。这说明BR信号通路与烟草的低温早花现象之间有密切联系。(3)对B-2基因编辑突变体植株进行了外源BR喷施实验。通过与野生型植株的对比,发现B-2突变体植株能够和野生型一样对外源BR作出迅速响应,使NtBRI1基因相对表达量发生骤增,但突变体植株不能顺利的将BR信号向下传递,导致其下游基因NtBSK3的表达量远远低于野生型植株。这证明B-2突变体中NtBRI1基因功能发生了缺失,一定程度上阻碍了BR信号通路中BR信号向下的传递。(4)将6叶期B-2基因编辑突变体植株和WT野生型植株进行不同温度处理后,对相关性状、基因表达量进行观察和检测,结果表明:处理10天结束后,B-2突变体植株生长发育速度突然增快,与野生型植株产生了显著地差异,这可能与BR对细胞分裂和细胞伸长的作用之间有密切联系,但具体分子机理有待进一步研究。现蕾期时,常温处理下两个品种现蕾时间差别不大,但低温处理下B-2突变体植株现蕾时间比野生型植株延迟5天,形成极显著差异。对基因相对表达量进行检测后,发现低温处理下B-2突变体植株与野生型相比,NtFLC基因表达量较高,而NtLFY基因表达量较低,这会对B-2植株花芽分化产生影响,最终导致花芽分化时间推迟。这说明B-2突变体植株NtBRI1基因功能的缺失导致了其现蕾时间的延迟,再次说明了BR信号通路与烟草低温早花之间联系密切。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S572
【部分图文】：

油菜素内酯,内酯,文献综述,信号转导途径

第 1 章文献综述第 1 章文献综述素内酯概述素内酯简介及其生理作用素内酯（brassinosteroid，BR）是种甾醇类植物激素，是继生素、脱落酸和乙烯之后发现的第六大植物激素。油菜素内酯于取并纯化出来[1]，它参与调控多种植物生长发育过程，如细胞伸期[4]、光形态建成[5]、抗逆性[6]等。素内酯信号转导途径号在植物体内的作用机理在近年来被越来越多的研究，并取得而整个 BRs 信号转导途径也随着研究的进行越来越清晰，总体过受体感知、胞内信号传递、下游调控因子激活三个步骤来完成

示意图,拟南芥,示意图,早花

谢如剑等也在研究中指出，烟草品种 G82 在持续 15d 的 12℃低温处理后会引发植株早花[68]。招启柏等的研究中也指出，对烟草成花的促进需要 10d 以上的持续低温诱导，短时间的低温诱导处理对烟草花芽分化的影响不大[75]。1.4.3 低温影响植物早花的分子机制在植物成花转变的过程中，CO、FT、FLC 和 SOCI 等基因共同作用，调控植物开花进程。研究表明，成花素(Florigen)就是植物叶片中合成的 FT 蛋白，它从叶片中由韧皮部传送到茎尖，继而与 FD 蛋白相结合，使 SOCI 基因的表达量升高，促进植物花芽分化[76]。FLC 是种开花抑制基因，其表达蛋白通过与 SVP 蛋白相结合，从而抑制 FT、SOCI 等基因的合成来调控植物开花进程。在对拟南芥春化作用的研究中，发现低温会对 FLC 基因的表达产生抑制作用，使 FLC 的 mRNA 丰度降低，且随着低温处理时间的增加，FLC 的表达越弱，最终引起拟南芥早花[77,78,79]。所以，低温春化作用是 FLC 基因的负调控因子，当植物受到长时间的低温诱导时，FLC 基因的表达量会大大降低，进而与 SVP 蛋白结合度降低，解除了对 FT、SOCI 等开花促进基因的抑制，进而致使植物早花[80,81,82]。

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图 3.1 NtBRI1 的 PCR 扩增电泳图Fig. 3.1 PCR amplification band of NtBRI1M： Super DNA maker；图中的 1、2、3 为扩增的 NtBRI1 条带；M: Super DNA maker; 1, 2 and 3 : Amplified NtBRI1band.表达载体的构建全双酶切 pEasy-T1- NtBRI1 后，凝胶电泳图显示了条带，因为 T 载体条带和目的片段条带大小相差将两个片段同时回收，在切胶时应尽可能多的切到 T 载体与目的片段重连，对胶回收产物进行了去磷全双酶切超量表达载体 pC2301M1DPB 的质粒后，。pC2301M1DPB 骨架与 NtBRI1 目的片段连接I1，将其转化到大肠杆菌 DH5α 中，涂至具有卡那液体培养，采用 2 组引物 F35S3N+NtBRI1R、RN

【参考文献】