控制水稻叶脉密度基因LVD2的图位克隆
发布时间：2020-09-30 09:12
植物叶脉系统是连接所有主要植物器官的连续维管束网络,能够长距离运输光合产物和土壤养分,并为植物体提供机械支持。C3植物水稻(Oryza sativa L.)是人类的主要粮食作物之一,但是却远远没有玉米(Zea mays L.)、高粱(Sorghum bicolor L.)等C4作物的生物量高。究其原因是C4植物的光合效率要比C3植物高。C4植物的叶脉密度要比C3植物高。因此,我们从C3水稻筛选了一批叶脉密度变化突变体,来研究控制叶脉密度的分子机制,进而创造类C4叶脉密度的材料。本论文以一个水稻叶脉密度增加的突变体为材料,并命名为lvd2(leaf vein density 2)。主要研究结果如下:1、在野生型与lvd2中,旗叶2 mm内分别有9条脉和12条脉,lvd2叶脉密度明显增加。与野生型相比,lvd2略矮化,叶片较窄,小脉的面积增大且两个小脉间叶肉细胞数减少。2、与野生型相比,lvd2的株高,千粒重,结实率,生物量,有效分蘖数均降低;有关光合作用的生理指标,气孔导度,胞间CO_2浓度,蒸腾速率均提高,但是光合速率是降低的。3、通过图位克隆的方法,发现LVD2的3个等位基因,并将这3个突变体分别命名为lvd2-1;lvd2-2;lvd2-3。它们具有相同的表型。lvd2-1是因为在第5个外显子上G变为T,导致相应的氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸;lvd2-2是由于在第9个外显子上单碱基A的缺失,导致移码突变,蛋白质翻译提前终止;lvd2-3是因为在第12个外显子上T变为C,导致相应的氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸。这三种突变均导致LVD2的失活,初步验证了该基因的功能。LVD2编码一个细胞周期相关蛋白,在禾本科内高度保守。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S511
【部分图文】：
2图 1.1 C3 植物和 C4 植物光合作用和解剖学结构的区别Figure 1.1 Differences in photosynthesis and anatomy between C3 plants and C4 plants (Furbank, et al. 2012)1.1.2 C4 光合作用的研究进展在过去十年中，基因组测序技术以及基于序列的 RNA 表达分析技术对 C4 植物的进化研究具有重要作用，同时一些特殊基因的发现对 C4 光合作用研究也产生了重大影响(Egan et al., 2012)。以序列的分子系统发育作为基础，为 C3 和 C4 植物的进化关系提供了新的见解，并且就 C4 植物进化枝之间的关系提供了许多新的发现(Grass Phylogeny Working Group II, 2012)。通过 RNA 测序（RNA-seq）将这些新的系统发育与全基因组测序和 RNA 表达分析相结合，使得能够在进化过程中鉴定出一系列基因。C4光合作用和相关转录因子可能是C4分子特化进化的原因(Aubry et al.,2014)。这一切通过比较来自密切相关的 C3 和 C4 物种和 C3-C4 中间体的序列信息来实现。为了将 C4 光合引入 C3 作物，建立了一个强有力的基因发现平台(von Caemmerer, Furbank,2012)。使用 RNA-seq 检测 C4 单子叶植物叶片发育梯度的基因表达模式(Li et al., 2010)。现在已
中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果与分析第三章 结果与分析3.1 lvd2 的表型分析通过手持显微镜观察并筛选出叶脉密度发生变化的突变体。通过观察成熟期突变体 lvd2 和野生型日本晴的旗叶，发现在 lvd2 中 2 mm 范围内有 12 条脉，而野生型中 2 mm 范围内有 9 条脉（图C）。叶脉密度明显增加，具有类似 C4 植物的解剖学结构。通过观察成熟期的植株，发现 lvd2 株高变矮大约是野生型的 75%（图 A）。叶片也相对变窄，大约是野生型的 67%（图 B，附录补充图）。通过徒手切片并在激光共聚焦显微镜下观察维管束的形态，发现 lvd2 中维管束的面积要比野生型的大 29%（图 D，附录补充图）。通过石蜡切片可以看出 lvd2 两个小脉间的叶肉细胞有 7个，在野生型中小脉间的细胞数通常是 11-12 个。因此 lvd2 叶脉变密的是因为小脉间的叶肉细胞数的减少，说明 LVD2 对水稻维管束的形成与发育非常重要，对细胞分裂与分化可能也有一定的影响。
图 3.2 野生型与 lvd2 光合作用相关生理指标测定图（A），（B），（C），（D）分别是野生型与 lvd2 光合速率，气孔导度，胞间 CO2浓度，蒸腾速率的统计分析比较。T 检验计算 P 值，**代表与野生型相比，P<0.01 水平差异极显著；*代表在 P<0.05 水平差异显著。Figure 3.2 Comparison of physiological indexes related to wild type and lvd2 photosynthesisA, B, C, D represents statistical analysis of photosynthetic rate, CO2stomatal conductance, CO2intercellularconcentration, transpiration rate, respectively. Values represent means ±SD from 3 biological samples. Asterisks indicatethe significance of the differences between WT and lvd2 as determined by Student’s t-test (*, 0.01≤ P<0.05; **, P ≤ 0.01)3.4 突变体 lvd2 的遗传分析叶脉变密的单株数量比为 3:1，根据孟德尔遗传定律可知，该突变表型由一对隐性基因控制。 该突变体源于前期实验室创制的以日本晴为背景 T-DNA 突变体库，已经过多代连续自交，是能够稳定遗传的纯系，由于该突变体的叶脉密度明显变密，因此将其命名为 lvd2。将突变体 lvd2与 Dular 进行杂交，得到 F1代杂交种。通过观察并发现 F1代的叶脉密度与亲本是一致的。再将F1代自交得到 F2代群体，发现性状发生了分离，包含叶脉密度变密的以及叶脉密度正常的 2 种
本文编号：2830648
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S511
【部分图文】：
2图 1.1 C3 植物和 C4 植物光合作用和解剖学结构的区别Figure 1.1 Differences in photosynthesis and anatomy between C3 plants and C4 plants (Furbank, et al. 2012)1.1.2 C4 光合作用的研究进展在过去十年中，基因组测序技术以及基于序列的 RNA 表达分析技术对 C4 植物的进化研究具有重要作用，同时一些特殊基因的发现对 C4 光合作用研究也产生了重大影响(Egan et al., 2012)。以序列的分子系统发育作为基础，为 C3 和 C4 植物的进化关系提供了新的见解，并且就 C4 植物进化枝之间的关系提供了许多新的发现(Grass Phylogeny Working Group II, 2012)。通过 RNA 测序（RNA-seq）将这些新的系统发育与全基因组测序和 RNA 表达分析相结合，使得能够在进化过程中鉴定出一系列基因。C4光合作用和相关转录因子可能是C4分子特化进化的原因(Aubry et al.,2014)。这一切通过比较来自密切相关的 C3 和 C4 物种和 C3-C4 中间体的序列信息来实现。为了将 C4 光合引入 C3 作物，建立了一个强有力的基因发现平台(von Caemmerer, Furbank,2012)。使用 RNA-seq 检测 C4 单子叶植物叶片发育梯度的基因表达模式(Li et al., 2010)。现在已
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图 3.2 野生型与 lvd2 光合作用相关生理指标测定图（A），（B），（C），（D）分别是野生型与 lvd2 光合速率，气孔导度，胞间 CO2浓度，蒸腾速率的统计分析比较。T 检验计算 P 值，**代表与野生型相比，P<0.01 水平差异极显著；*代表在 P<0.05 水平差异显著。Figure 3.2 Comparison of physiological indexes related to wild type and lvd2 photosynthesisA, B, C, D represents statistical analysis of photosynthetic rate, CO2stomatal conductance, CO2intercellularconcentration, transpiration rate, respectively. Values represent means ±SD from 3 biological samples. Asterisks indicatethe significance of the differences between WT and lvd2 as determined by Student’s t-test (*, 0.01≤ P<0.05; **, P ≤ 0.01)3.4 突变体 lvd2 的遗传分析叶脉变密的单株数量比为 3:1，根据孟德尔遗传定律可知，该突变表型由一对隐性基因控制。 该突变体源于前期实验室创制的以日本晴为背景 T-DNA 突变体库，已经过多代连续自交，是能够稳定遗传的纯系，由于该突变体的叶脉密度明显变密，因此将其命名为 lvd2。将突变体 lvd2与 Dular 进行杂交，得到 F1代杂交种。通过观察并发现 F1代的叶脉密度与亲本是一致的。再将F1代自交得到 F2代群体，发现性状发生了分离，包含叶脉密度变密的以及叶脉密度正常的 2 种
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本文编号：2830648
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