油菜核不育材料7365A恢复基因Bnams4~a的功能验证

发布时间：2020-10-19 10:00

　　 细胞核雄性不育是我国油菜杂种优势利用的重要途径之一。甘蓝型油菜细胞核雄性不育材料7365系统的育性被认为受两对基因控制,即BnaMs3/Bnams3和Bnams4~a/Bnams4~b/Bnams4~c。前人推测Bnams4~a可能是通过DNA甲基化相关过程恢复Bnams4~b导致雄性不育。本研究在前人基础上,通过对仅在Bnams4~a位点分离的736512AB近等基因系进行了全基因组重亚硫酸盐测序比较分析;通过转化反向重复表达载体等实验,对前人提出的sRNA通过RNA介导的DNA甲基化(RNA directed DNA methylation,RdDM)调控育性的观点进行验证;通过BAC的单分子实时测序(single molecule real time,SMRT)对与Bnams4~a紧密连锁的基因进行验证与排除;在甘蓝型油菜7365A中进行Bnams4~a全长序列的遗传转化验证,并对启动子中的串联重复序列进行截短分析。本研究的取得的主要结果如下:1.构建了736512AB近等基因系的全基因组重亚硫酸盐测序文库,完成了甘蓝型油菜花蕾全基因组DNA甲基化图谱。可育和不育文库的整体甲基化水平分别为12.23%和13.00%,没有显著差异。两个文库中不同序列背景下的DNA甲基化水平都是CGCHGCHH。DNA甲基化在各条染色体上并非均匀分布,整体甲基化水平和CG、CHG、CHH序列环境的甲基化水平上,A_n亚基因组显著低于C_n亚基因组。花蕾中DNA甲基化平均水平低于根与叶片。2.基因区与重复序列区域甲基趋势不同:在启动子区甲基化水平最高,随着远离转录起始位点,甲基化水平迅速升高,直至稳定水平;gene body区甲基化水平明显要低,而其中内含子区相对外显子和UTR区较高。而重复序列区本身呈现出中间低而两侧高的趋势,上下游1kb甲基化水平相对较低。3.可育与不育材料间存在局部甲基化差异:779个差异甲基化区间(differentially methylated region,DMR)中,低甲基化的DMR明显较高甲基化的DMR多。在402个差异甲基化基因中鉴定到11个潜在的与花粉发育相关的基因,其中10个基因表达量有差异。随机挑选8个基因进行常规重亚硫酸盐测序验证,结果与全基因组甲基化测序一致。此外,Bnams4的gene body区DNA甲基化差异明显,表达量差异显著。4.通过构建调控区反向重复载体转入Bnams4~b背景拟南芥中,显著提高了Bnams4~b靶区间的DNA甲基化水平,而表达量没有改变,育性也没有恢复;在拟南芥中超表达Bnams4~a的gDNA得到的是雄性不育表型,Bnams4~a全长转化野生型拟南芥也是雄性不育表型。排除了Bnams4~a通过调控区sRNA经RdDM路径恢复育性的推测。5.通过单分子实时测序(SMRT),完成了Bnams4~a和Bnams4~b BAC的完整拼接,序列比较显示,在Bnams4~a上游5kb左右的位置,新发现两个插入片段。806上预测编码一个未知功能蛋白,1667上预测编码一个甲基转移酶。将含两个片段的序列分别构建互补载体对Bnams4~b背景拟南芥进行遗传转化,均不能恢复Bnams4~b的育性,基本排除Bnams4~a为Bnams4~b紧密连锁基因的可能。6.Bnams4~a全长对甘蓝型油菜7365A全不育材料进行遗传转化,得到138株阳性苗,其中81株育性得到恢复。育性恢复株gene body区DNA甲基化水平显著降低,Bnams4表达量显著降低。7.Bnams4启动子由3段串联重复(tandem repeat,TR)序列TR1、TR2和TR3正向串联组成,通过构建不同数目串联重复序列驱动Bnams4 CDS表达载体转化野生型拟南芥。结果发现:仅有5’UTR驱动Bnams4表达时,所有转基因拟南芥均表现雄性可育;一个或多个串联重复驱动Bnams4表达时,部分或所有阳性苗均表现为雄性不育。这些结果说明Bnams4启动子中串联重复序列是其表达所必需的。本研究对油菜花蕾尽行了全基因组甲基化分析,排除了Bnams4~a启动子区差异导致的育性变化,排除了与Bnams4~a紧密连锁的育性恢复基因,通过在油菜7365A中成功的对Bnams4~a进行了互补验证。本研究完善了油菜全基因组甲基化图谱、对7365A育性恢复及嵌合新基因的表达调控机制的解析奠定了基础。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.4
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1 前言
    1.1 植物中DNA甲基化
    1.2 DNA甲基化状态的建立、维持与去除
    1.3 DNA甲基化的功能
        1.3.1 启动子DNA甲基化与基因表达调控
        1.3.2 Gene body区 DNA甲基化的功能
    1.4 DNA甲基化分析方法
    1.5 DNA甲基化在植物雄性不育中的研究
    1.6 甘蓝型油菜全基因组DNA甲基化研究
    1.7 油菜雄性不育与杂种优势利用
    1.8 S45A雄性不育分子机理研究进展
        1.8.1 Bnms1和Bnms2 的定位与克隆
        1.8.2 S45A育性控制机理
    1.9 9012A/7365A雄性不育分子机理研究进展
        1.9.1 BnaMs3 的图位克隆与及其新功能化
        1.9.2 9012A/7365A遗传模式修正
        1.9.3 Bnams4~b的图位克隆
        1.9.4 7365A育性控制的分子机理研究
    1.10 显性核不育宜3A雄性不育分子机理研究进展
        1.10.1 BnaMs5的定位与克隆
        1.10.2 显性核不育的育性控制机理
    1.11 细胞核不育利用途径
    1.12 本研究的目的和意义
2 材料和方法
    2.1 油菜材料
    2.2 拟南芥材料
    2.3 菌株与载体
    2.4 全基因DNA甲基化测序与分析
        2.4.1 文库构建与全基因组重亚硫酸盐测序
        2.4.2 测序质量控制
        2.4.3 比对到参考基因组
        2.4.4 差异甲基化区域(DMR)分析
    2.5 常规重亚硫酸盐PCR测序验证
    2.6 RNA提取、反转录与荧光定量PCR
    2.7 载体构建
        2.7.1 反向重复载体构建
        2.7.2 gDNA超表达的构建
        2.7.3 CRISPR/Cas9 载体构建
        2.7.4 互补载体构建
        2.7.5 启动子截短载体构建
    2.8 简单粗暴法提取DNA
    2.9 BAC的单分子实时测序与拼接
    2.10 花药醋酸洋红染色
    2.11 花药亚历山大染色
    2.12 甘蓝型油菜遗传转化
    2.13 拟南芥根外植体遗传转化
    2.14 拟南芥蘸花法遗传转化及转基因阳性苗筛选
3 结果与分析
    3.1 近等基因系表型观察
    3.2 油菜花蕾全基因组甲基化分析
        3.2.1 油菜花蕾全基因组甲基化图谱
        3.2.2 差异甲基化位点分析
        3.2.3 差异甲基化基因验证
        3.2.4 育性相关基因定量PCR验证
    3.3 Bnams4甲基化与表达分析
    3.4 sRNA区转基因验证
        3.4.1 sRNA超表达表型分析
        3.4.2 sRNA超表达DNA甲基化与基因表达分析
        3.4.3 CRISPR/Cas9编辑sRNA区结果
        3.4.4 gDNA超表达转基因结果
    3.5 Bnams4~a转化拟南芥结果
    3.6 BAC的重新测序与验证
        3.6.1 BAC单分子实时测序与分析验证
        3.6.2 新发现的2个基因的转基因验证
    3.7 Bnams4~a油菜转基因验证
        3.7.1 Bnams4~a全长转化不育背景油菜
        3.7.2 育性恢复株中Bnams4 甲基化与表达分析
    3.8 Bnams4 启动子tandem repeat初步分析
4 讨论
    4.1 油菜花蕾全基因组甲基化图谱
    4.2 WGBS在鉴定育性相关基因中的应用
    4.3 Bnams4调控区的sRNA可能不是育性恢复的原因
    4.4 Bnams4~a是Bnams4~b的复等位基因
    4.5 Bnams4~a恢复育性的可能机制
参考文献
附录Ⅰ
    附录1 油菜下胚轴遗传转化培养基配方
    附录2 拟南芥根外植体遗传转化配方
    附录3 使用SeqMan批量去除载体序列流程
    附录4 本研究所用BS PCR和q-RT PCR引物
    附录5 本研究用到的其他引物
        附图1 19条染色体在三种序列环境下的DNA甲基化分布
        附图2 ChrC1上24MB位置处的一个局部DNA甲基化差异
        附图3-1 3个基因的常规重亚硫酸盐PCR验证
        附图3-2 2个基因的常规重亚硫酸盐PCR验证
        附图4 806 ORF与 BnaA06g31090D氨基酸序列比较
        附图5 1667 ORF与拟南芥同源基因氨基酸序列比较
        附图6 油菜CRISPR/Cas9植株T2 代混合测序结果
附录Ⅱ:作者简历及研究生阶段发表论文成果
    作者简历
    文章发表
致谢

【参考文献】

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本文编号：2847060