玉米两个重要位点的定位与克隆
发布时间：2020-10-20 02:52
干旱胁迫是全球农业生产面临的重大挑战。减少植株水分散失是提高玉米抗旱性的重要途径之一,玉米叶萎蔫突变体是研究水分散失的重要材料。研究叶萎蔫突变体基因的生物学功能和作用机理,将提高我们对玉米水分吸收、运输和散失的调控机理的认识,在此基础上可通过遗传改良的手段有目的地改良影响水分散失的关键性状,提高玉米抗旱性。本研究以来源于自交系Lian87自然突变获得的叶片萎蔫的多性状变异突变体multi-trait weakened(muw)为材料,开展了突变位点的定位及遗传分析,探究导致突变表型产生的遗传学机制。另外,玉米穗行数是决定玉米产量的最重要性状之一;因此,克隆控制玉米穗行数变异的关键基因,发掘其优良等位基因,解析基因的功能,不仅有助于阐明穗行数形成的遗传基础,也为玉米穗行数的遗传改良提供理论指导及优良的基因资源。本研究采用图位克隆策略精细定位并克隆了一个新的控制玉米穗行数主效QTL KRN8.03,并利用表达分析和候选基因关联分析等手段初步证实了该基因的生物学功能及功能位点。获得的主要研究结果如下:1、突变体表型分析。muw全株叶片萎蔫卷曲,从叶尖到叶边缘逐渐干枯死亡,田间高温干旱的情况下,萎蔫表型更明显。与野生型植株相比,突变体植株的生长发育及产量均受到严重的影响。突变体叶片水分散失速率快于野生型。另外,通过水分运输相关的维管束数目、维管束中导管数目、水分散失相关的ABA含量、ABA敏感性、叶片蜡质层和叶片气孔数目等在突变体和野生型植株间的比较分析,发现突变体叶片气孔密度显著高于野生型叶片气孔密度(P=1.86×10~(-7)),其它性状均在野生型和突变体之间无显著性差异。2、muw的遗传定位。遗传分析发现muw叶片萎蔫性状受单隐性位点控制,通过BSA方法将muw定位在第2染色体标记umc1485和umc1635之间;随后利用图位克隆策略进一步将muw定位于标记V78和V140间5.66Mb的区间内。进而根据区段内交换率的比较分析和PCR扩增结果,推测muw基因组在定位区间内存在大片段缺失。3、大片段缺失的位置确定与验证。利用分布在定位区间内的82对引物对muw和野生型基因组DNA进行PCR扩增,根据能否扩增出PCR产物判断目标片段是否缺失,结合测序分析,最终确定muw基因组中缺失一个长达5,161,714 bp(chr2:70,474,267–75,635,980 AGP_v4)的片段,内含48个候选基因。基因组PCR扩增结果表明,在muw基因组中,缺失片段内含有的48个候选基因均扩增不出产物,但是在野生型和其它叶片表型正常的自交系中48个候选基因均能扩增出产物;此外,还发现20个在野生型苗期叶片中有表达的基因在muw中检测不到表达;说明片段确实缺失。4、穗行数QTL连锁分析与KRN8.03精细定位。利用V54×Lian87 F_(2:3)分离群体,在4个环境下共检测到12个控制玉米穗行数的QTL,其中KRN2,KRN4-2和KRN8.03在4个环境下均检测到,且至少有1个环境可解释的表型变异大于10%。进而利用高代回交群体为材料及子代测验方法开展KRN8.03的精细定位,最终将其定位在标记M9和M11之间约150kb的区间内,该区间内只有一个候选基因,命名为KRN8.03。5、KRN8.03候选基因关联分析结果表明,位于外显子上的4个LD的SNP与穗行数显著相关,但只有SNP493造成氨基酸错义突变。显著关联的4个SNP构成的2种单倍型中,Hap1为增效单倍型。qRT-PCR结果表明KRN8.03在近等基因系KRN8.03~(Lian87)和KRN8.03~(V54)的幼穗中表达差异达显著水平(P0.05)。6、载体构建及遗传转化。构建了KRN8.03的超表达载体和基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑载体,已获得超表达转基因材料的T1代种子和基因编辑材料的T0代种子。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S513
【部分图文】：
图 1 玉米基因组 bz 区域在三个玉米自交系间的比较。基因，大倒三角表示转座子。蓝色的小倒三角代表 MITE（miniature i element）。缺失片段表示为虚线。图片引自 Dooner and He 2008。Fig. 1 Organization of the bz genomic region in three different haplotyphown as pentagons. Transposons are shown as large inverted triangles inch occur in introns and intergenic regions, are shown as small blue triangl is missing in B73. Figure came from Dooner and He 2008.阵列比较基因组杂交技术比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization，aC测人类和植物全基因组结构变异的技术。其原理是将不同荧待测基因组和参考基因组的 DNA 杂交到一个微阵列上，这数千个根据已知基因序列开发的探针。如果在某一位点上待列杂交信号强度显著偏离1:1比率，说明此处存在CNV或PA
玉米两个重要位点的定位与克隆尽链球菌的可有可无基因组。而炭疽杆菌仅需要 4 个菌株的基因组就an-genome (Tettelin et al 2005)。玉米中也开展了构建 pan-genome 的实 et al 2014, Lu et al 2015)，但是玉米基因组中大量的重复序列和结构变nome 构建过程中要面临的一个最大的挑战。上这些基因组 SVs 检测方法都有自身的优点和缺点，而且到目前为止可以检测出某一物种所有的结构变异，最近有研究开始考虑结合不同以用于 SVs 的检测(Escaramis et al 2015)。
华中农业大学 2018 届博士研究生学位论文析描述和分析表型观察系 Lian87 田间繁种的过程中，我们发现一株叶片萎自交后代也表现为与亲本一样的全株叶片萎蔫，说变体命名为 muw（ multi-trait weakened）。田间观察 5 叶期以前，突变体和野生型叶片均不萎蔫，随着出现明显的萎蔫卷曲表型，首先叶尖干枯发黄，随整个叶片褪绿，叶边缘更严重，田间高温干旱情况
本文编号：2848100
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S513
【部分图文】：
图 1 玉米基因组 bz 区域在三个玉米自交系间的比较。基因，大倒三角表示转座子。蓝色的小倒三角代表 MITE（miniature i element）。缺失片段表示为虚线。图片引自 Dooner and He 2008。Fig. 1 Organization of the bz genomic region in three different haplotyphown as pentagons. Transposons are shown as large inverted triangles inch occur in introns and intergenic regions, are shown as small blue triangl is missing in B73. Figure came from Dooner and He 2008.阵列比较基因组杂交技术比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization，aC测人类和植物全基因组结构变异的技术。其原理是将不同荧待测基因组和参考基因组的 DNA 杂交到一个微阵列上，这数千个根据已知基因序列开发的探针。如果在某一位点上待列杂交信号强度显著偏离1:1比率，说明此处存在CNV或PA
玉米两个重要位点的定位与克隆尽链球菌的可有可无基因组。而炭疽杆菌仅需要 4 个菌株的基因组就an-genome (Tettelin et al 2005)。玉米中也开展了构建 pan-genome 的实 et al 2014, Lu et al 2015)，但是玉米基因组中大量的重复序列和结构变nome 构建过程中要面临的一个最大的挑战。上这些基因组 SVs 检测方法都有自身的优点和缺点，而且到目前为止可以检测出某一物种所有的结构变异，最近有研究开始考虑结合不同以用于 SVs 的检测(Escaramis et al 2015)。
华中农业大学 2018 届博士研究生学位论文析描述和分析表型观察系 Lian87 田间繁种的过程中，我们发现一株叶片萎自交后代也表现为与亲本一样的全株叶片萎蔫，说变体命名为 muw（ multi-trait weakened）。田间观察 5 叶期以前，突变体和野生型叶片均不萎蔫，随着出现明显的萎蔫卷曲表型，首先叶尖干枯发黄，随整个叶片褪绿，叶边缘更严重，田间高温干旱情况
本文编号：2848100
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