苦荞芦丁水解酶的序列鉴定及表达纯化

发布时间：2020-10-30 16:47

　　 在食品加工过程中,以荞麦尤其是苦荞麦为原料制备的食品存在一定的苦涩味,严重影响口感,降低了荞麦的利用价值。芦丁水解酶(rutin-hydrolyzing enzyme,RHE)通过水解芦丁生成的槲皮素是其苦涩味产生的主要原因。因此,若将苦荞芦丁水解酶基因(Fagopyrum tartaricum rutin-hydrolyzing enzyme,FtRHE)敲除,则有可能获得无苦涩味的荞麦,更加有利于荞麦的利用及推广。尽管国内外在芦丁水解酶的性质、底物特异性等方面已经做了一些的研究,但是迄今为止还未见RHE的DNA序列的相关报道。本课题组从苦荞转录组中克隆得到芦丁水解酶基因FtRHE并在昆虫杆状病毒系统中进行表达研究。主要完成以下研究内容:1.FtRHE基因的序列鉴定。为获得苦荞麦中FtRHE基因,以云荞1号苦荞种子为材料,制备获得天然RHE,通过MALDI-TOF/TOF-MS鉴定天然RHE序列信息,结合转录组数据,筛选FtRHE。结果显示,纯化的天然RHE分子量约为62 kD,肽质量指纹图谱证明其为一种β-葡萄糖苷酶,质荷比为914.4286的肽段FSISWSR为其特征肽段。在苦荞种子转录组数据中筛选获得FtRHE基因序列基础上,通过反转录PCR获得了苦荞芦丁水解酶基因FtRHE。FtRHE开放阅读框由1539个碱基组成,编码512个氨基酸,1-29位氨基酸为其信号肽。多重序列比对表明RHE与有物种差别的β-葡萄糖苷酶氨基酸保守性不是特别高,同源性普遍集中在54%—62%之间。由生物化学,分子生物学方法结合软件分析发现,RHE分子中有4个疏水区;它的二级结构由48.44%无规则卷曲、37.30%α-螺旋和14.26%β-折叠组成;其结构域含有与糖苷水解酶家族1相同的(β/α)8TIM桶状结构域。进一步根据芦丁水解酶相关结构预测,发现其活性位点可能是第200位的谷氨酸和第412位的谷氨酸。2.FtRHE基因表达系统的构建及表达。为了获得与天然RHE相同生物学活性的重组型RHE,为后续功能研究奠定基础,我们首先构建了FtRHE的原核表达载体,其中包括PRSETC、pGEX-4T-1、pET-32a这些在大肠杆菌中表达的载体,并通过测序鉴定正确再进行诱导表达,结果未发现特异条带。我们尝试基于大肠杆菌的密码子偏好优化序列,去掉信号肽区域表达仍未成功。因此,改用昆虫杆状病毒表达系统,首先构建真核表达载体,通过转化DH10Bac感受态细胞构建Bacmid-FtRHE重组杆粒,转染昆虫细胞Sf9后,成功表达了具有较高芦丁水解酶活性的重组FtRHE。酶活测定实验结果表明,我们表达的FtRHE与苦荞中天然提取的RHE活性类似。该研究为高含量芦丁及无苦涩味荞麦育种以及由芦丁生物转化生产槲皮素等的应用奠定了良好的基础。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S517;Q943.2
【部分图文】：

第二章 FtRHE 基因的序列鉴定ro 8.5、Microsoft Office Excel 2003、Photosho白胶以及核酸胶图进行图像处理。酶制备芦丁降解酶在荞麦中存在多种同工酶[39]，从小，催化性质等方面也不同。因此，本文在取，RHE 基因克隆等实验，均采用云荞 1 号法，成功纯化了该蛋白，SDS-PAGE 分析显示的 nRHE 与唐宇等从野生金荞麦籽粒中纯化定，纯化的蛋白可以将天然底物芦丁脱去芸分之九十五以上。表明纯化的蛋白具有芦丁鉴定实验。

苦荞芦丁水解酶的序列鉴定及表达纯化萄糖苷酶。PMF 质荷比为 914.4286 在很多的糖苷酶中均被发现，说明该 2712.1331 的肽段 ALDFMFGWFANPIi/356557126, vicianin beta-glucosidase, G肽段IANGTTGDVADDFYHR被鉴定glucosidase 12,Ananas comosus） 序列萄糖苷酶。隆们获得了分子量约为 1600 bp 的条带（asy 载体连接，经测序确定其基因序列基组成，编码 512 个氨基酸，预测的分库登录，登录号为：2055990。

第二章 FtRHE 基因的序列鉴定列 TVSRSSFPDGFLFGL 同源性更高[34]，因此 1-29 位氨基酸更有可能为其苦荞麦中的 RHE 与 GenBank 中选取的其它物种来源，且功能明确的β-葡，用 Clustal W 对其进行多重序列比对，发现该基因在各物种间的保守性不，相似性普遍集中在 54%-62%之间。如 Fig. 2.4 所示，不同来源的β-葡萄糖号肽序列保守性都比较差，其它氨基酸序列的保守性相对较高。多肽序列 F不同来源的β-葡萄糖苷酶序列都完全一致。经 MALDI-TOF/TOF-MSLDFMFGWFANPITFGDYPESMR 和 IANGTTGDVADDFY HR 在不同来源糖苷酶中序列保守性也较高。但是这两个肽段在 FtRHE 基因编码的氨基酸不完全一致，原因可能是荞麦中存在多种同工酶所致。
【参考文献】

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本文编号：2862748