药用真菌猪苓菌核cDNA文库构建及部分生物信息学分析

发布时间：2020-11-02 01:19

　　 猪苓[Polyporus umbellatus(Pers.)Fr.]是一种药用真菌,具有利尿去水肿的作用;它的生长经历有三个阶段:菌核、菌丝、子实体,其中菌核为药用部分,本论文通过研究猪苓菌核的表达序列标签(EST),为深入研究猪苓菌核的形成机制,分析物种在基因组学上的差异提供理论依据。以采自陕西省佛坪县的三年生猪苓菌核为原材料,通过EASY spin植物快速提取试剂盒提取总RNA,经电泳检测条带清晰,OD260/280在2.0-2.1之间,产量符合反转录的要求;利用SMART法成功构建了猪苓菌核的cDNA文库,原始文库滴度为6.55×106pfu/ml,重组率为94.26%,插入片段长度均大于100bp,扩增文库滴度为1.821×1010pfu/ml,符合一个质量较好的文库标准。随机选取500个单克隆进行单方向测序,获得高质量序列共371条,平均长度为383bp;经聚类拼接后得到包含127条ESTs的共46个重叠群和244个单拷贝序列,形成了共290条单基因簇,文库的冗余度为21.83%;参照植物基因功能目录对照与nr数据库已知功能序列相似性高的序列推测其蛋白质具有的功能共分为11类,分别为蛋白质合成、疾病/防御、代谢、信号转导、能量、转运、细胞生长/分裂、转录、细胞结构、胞内途径及次生代谢。仅有160条序列获得一条或一条以上GO功能基因注释;其中被注释为细胞组分(Cellular component)的包括9种功能;被注释为生物学过程(Biological process)的包括15种功能;被注释为分子功能(Molecular function)的包括3种功能。将所得序列提交到KEGG数据库进行比对,共有116个基因获得了 Knumber,其中有98个基因被带入到通路中,涉及到的通路共153条;其中基因参与最多的通路为代谢(metabolic pathway),共有22个基因参加;根据与nr数据库中已知蛋白质序列高同源性为原则,选取10条与nt/nr数据库内已登陆基因高同源性序列,并对其高同源性基因及其编码蛋白进行分析,预测未知基因及蛋白质的功能与结构。
【学位单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.3
【部分图文】：

图１中国猪苓资源分布地图??Ｆｉｇｌ?．Ｔｈｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ?ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ?ｉｎ?Ｃｈｉｎａ??３有关猪苓在分子生物学领域的研究概况??近年来有关猪苓的遗传多样性、种群差异结构、功能基因克隆分析等多物学研宄正在逐步开展。??刘开辉等［５－７］对三种不同形态猪苓菌核的ｒＤＮＡ?（１８ｓ?ｒＤＮＡ和ＩＴＳ１－５－ＩＴＳ２）和ｐ－ｔｕｂｌ进行扩增测序比对，结果表明三种形态的猪苓菌核的ｒＤ

图２两种方法提取猪苓菌核总ＲＮＡ??Ｆｉｇ２?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡｓ?ｆｒｏｍ?ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ?ｏｆ?Ｐ．?ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ?ｕｓｉｎｇ?ｔｗｏ?ｍｅｔｈｏｄｓ??如图２所示，试剂盒法所提取的总ＲＮＡ，２８ｓ与１８ｓ十分清晰，亮度比约为??２：１，且５ｓ处的条带比较清晰，说明ＲＮＡ的完整性比较好，未发生降解；而Ｔｒｉｚｏｌ??改良法所提取的总ＲＮＡ，?５ｓ处的条带要明显亮于２８ｓ与１８ｓ，且出现了拖尾现象，??说明ＲＮＡ的完整性很差，己经发生了降解。??表１不同方法提取猪苓菌核纯度与产置比较??Ｔａｂｌｅ?１?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｑｕａｌｉｔｙ?ａｎｄ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｂｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｍｅｔｈｏｄ??方法?样品编号?＾?产量（Ｈｇ／ｇ）???Ｍｅｔｈｏｄｓ?Ｓａｍｐｌｅｓ?‘⑷？８０?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ??试剂盒法?１?２．０６?２．４６??ＥＡＳＹ?Ｓｐｉｎ?Ｐｌａｎｔ?ＲＮＡ?ｋｉｔ?２?２?０９?３?３１??ｍｅｔｈｏｄ??Ｔｒｉｚｏｌ?改良法?３?２．２４?６．４３??Ｉｍｐｒｏｖｅｄ?Ｔｒｉｚｏｌ?ｍｅｔｈｏｄ?４?２．２６?６．９４??纯的ＲＮＡ样品ＯＤ２６Ｇ／２８０应在１．７－２．２之间，若ＲＮＡ样品的ＯＤ２６〇／２８〇比值太??小，表明有蛋白质或酚污染？，当ＯＤ２６０／２８０大于２．２时，说明ＲＮＡ己经水解成单核??酸了如表中所示，采用试剂盒法所提取的ＲＮＡ样品ＯＤ值均在２．０－２．１之间，??说明ＲＮＡ纯度较好；采用Ｔｒｉｚｏｌ改良法所提取的ＲＮＡ样品ＯＤ值均大于２．２

ＬＤ－ＰＣＲ所得到的ｄｓ－ｃＤＮＡ经蛋白酶Ｋ消化，Ｓｆｉ?Ｉ酶切及ＣＨＲＯＭＡ??ＳＰＩＮ－４００分级分离后，得到１６管修饰后的产物，１％琼脂糖凝胶电泳检测得到如??图４所示：??■物．．丨．．．．???｜????：?—??ＢＨＨ??１－１６?修饰后的?ｄｓ－ｃＤＮＡ，Ｍｌ?ＤＬ１５０００?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｍ２?ＤＬ?２０００?Ｍａｒｋｅｒ??图４?ｃＤＮＡ分级分离??Ｆｉｇ?４?Ｔｈｅ?Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃＤＮＡ??如图４所示，第９－１２管的ｃＤＮＡ片段长度均大于７５０ｂｐ，合并这四管的产物??并进行纯化。??３．４原始文库滴度与重组率检测??原始文库经稀释１００倍后进行倒板培养，分别进行滴度的测定及蓝白斑筛选??（表?２）：??７??
【参考文献】

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本文编号：2866371