胁迫作用对乌拉尔甘草种子幼苗及愈伤组织的诱导培养

发布时间：2020-11-04 10:50

　　 乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)为豆科(Leguminosae sp.)甘草属(Glycyrrhiza Linn.)多年生草本植物,主要分布在新疆、内蒙古和甘肃等地区。作为我国的大宗药材之一,其市场需求量巨大,由于近年来甘草药材的产量和质量急剧下降,因此,培育生产优质的甘草药材已成为最佳解决办法。本文旨在通过研究多种胁迫作用对乌拉尔甘草生长的影响以科学地指导优质甘草的栽培生产,同时应用植物组织培养技术扩大甘草资源,以更快、更好、更便捷的方式得到甘草的次生代谢产物,可为甘草在医药和食品等产业上提供更优质的资源。本论文第一部分研究盐碱胁迫、干旱胁迫以及双重胁迫对乌拉尔甘草种子发芽率、发芽势、发芽指数以及幼苗的根长、茎长、鲜重指标的影响,同时对各胁迫下的乌拉尔甘草幼苗进行生理生化特性研究分析。结果显示:乌拉尔甘草种子及幼苗对两种盐胁迫均有抗盐性,其耐盐程度为NaClNa_2CO_3,并且两种胁迫在低浓度下显著促进种子萌发、幼苗生长、酶活性的增加以及可溶性物质的积累,而高浓度呈抑制状态,其最佳胁迫浓度为25mmol/L;干旱胁迫下,轻度干旱胁迫可促进种子萌发以及幼苗生长,其最佳胁迫浓度为4%,此胁迫浓度下,幼苗保持高酶活性并且提高了渗透调节物质含量;双重胁迫下,随胁迫的加剧,种子萌发指标、幼苗生长状况和生理生化特性受到抑制。轻、中度干旱以及适量盐碱成分可增加乌拉尔甘草的抗逆性,以25+25mmol/L的NaCl+Na_2CO_3和4%PEG-6000为最适宜。第二部分利用Box-Behnken响应面法优化诱导乌拉尔甘草愈伤组织的最佳激素配比,选用2,4-D、6-BA、KT三种激素进行组合诱导。结果以下胚轴为外植体的最佳激素为:6-BA 0.63 mg/L+2,4-D 1.75 mg/L+KT 2.00 mg/L,幼根:6-BA 0.22 mg/L+2,4-D 1.63mg/L+KT1.98mg/L。第三、四部分主要是在建立乌拉尔甘草愈伤组织培养体系中进行诱导子的添加,考察愈伤组织增长量以及采用HPLC方法进行甘草苷、甘草酸的含量测定与比较。结果:3种诱导子对愈伤组织的影响存在较大的差异,壳聚糖最适合提高乌拉尔甘草愈伤组织鲜重、干重的增长,最佳浓度的增长量为3.6629、0.3158g,而茉莉酸甲酯和水杨酸均不适合。定量分析结果为:壳聚糖可促进甘草酸的积累,且在低浓度时可以提高甘草苷的含量;水杨酸虽抑制了甘草酸的积累,但对于增加甘草苷含量有促进作用;茉莉酸甲酯可在低浓度时,促进甘草酸含量的增加,但对甘草苷的积累呈抑制状态。由此可表明,乌拉尔甘草的次生代谢产物可由愈伤组织培养体系的建立和扩大培养完成快速大量的积累。本试验考察了多种胁迫作用对乌拉尔甘草种子幼苗的影响,得知各胁迫下的乌拉尔甘草种子及幼苗具有一定的抗盐碱性和抗旱性。同时也利用了响应面法探讨了最佳诱导乌拉尔甘草愈伤组织的激素配比。在此基础上添加不同诱导子,提高了次生代谢产物的积累。为今后规范化的人工栽培技术提供可靠依据,也为丰富乌拉尔甘草组织培养技术增添新理论依据。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.71
【部分图文】：

图 4-1 不同激素种类与愈伤组织诱导系数的响应面分析图（下胚轴）Fig.4-1 Response surface analysis of different hormone types and callus induction rate（hypoco4.5.2 幼根诱导结果根据表 4-2 实验组结果，对试验数据进行分析，其回归方程的显著性检验及方见表 4-4。表 4-4 为二次模型中回归系数的显著性检验，表明 2，4-D 和 KT 对愈伤组织诱性效应显著（P<0.05），因素 B2、C2对愈伤组织诱导系数的曲面效应显著，因素 A伤组织诱导系数的交互影响显著，AB、AC 、BC、A2对愈伤组织诱导系数交互影著。对试验数据进行多次拟合回归，以诱导系数（Y）为因变量，2，4-D(A)、6-BKT(C)为自变量建立回归方程模型为：Y=+0.6250+2.25A+6.75B-1.00C-0.25AB-1.75AC+0.25BC-0.625A2-2.125B2+1.8750C2模型的回归 F 值为 7.01，P<0.05，表明该回归显著，模型对试验实际情况拟合失拟项不显著（P>0.05），相关系数 R2=1.0000，校正决定系数 R2adj=0.7716,表明该实际的试验拟合程度良好，误差小，模型选择合适，可以用该模型对响应值进行分测来确定最佳诱导愈伤组织的激素组合。

图 4-2 不同激素种类与愈伤组织诱导系数的响应面分析图（幼根）Fig.4-2 Response surface analysis of different hormone types and callus induction rate（radicle）4.6 小结利用响应面法对 6-BA、2，4-D、KT 三种激素进行优化，获得以下胚轴为外植体的导愈伤组织的激素浓度为 6-BA 0.63 mg/L + 2,4-D 1.75 mg/L + KT 2.00 mg/L，以幼根为植体的激素浓度为 6-BA0.22 mg/L +2,4-D 1.63mg/L+KT 1.98mg/L。预测乌拉尔甘草愈伤织诱导系数分别为 11.87、11.79，经验证，实际乌拉尔诱导系数为 11，与预测值相差 00.79，验证了预测结果的正确性，说明响应面分析法得到的激素浓度真实可靠。

样品在 24h 之内稳定性良好。6.4.8 加样回收率试验精密称取同一乌拉尔甘草愈伤组织粉末样品 0.2g，共 5 份，分别加入混合对照品溶液1、2、3、4、5mL，按照“6.4.1”方法制备待测样品溶液，按“6.4.3”色谱条件测定峰面积，计算加样回收率，结果甘草苷、甘草酸加样回收率分别为 97.96%、98.24%，RSD 为 2.21%、2.57%。6.4.9 样品含量测定取添加不同诱导子培养的乌拉尔甘草愈伤组织粉末样品，按照“6.4.1”制备待测样品溶液，按“6.4.3”色谱条件进行检测，记录峰面积，测定结果见 6.5。6.5 结果与分析
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本文编号：2869997