甘蔗SoACLA-1基因遗传稳定性分析及功能验证

发布时间：2020-11-06 14:41

　　 甘蔗是中国主要的糖料作物,干旱是限制可持续甘蔗生产的最具挑战性的农业问题之一。ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)是植物生长发育中的关键酶,其功能之一是能够提高植物的抗逆性,SoACLA-1基因是编码甘蔗ATP-柠檬酸裂解酶蛋白的一个亚基的基因。本课题组前期构建了以玉米ubi为启动子的SoACLA-1基因的真核表达载体PUBTC-SoACLA-1,并利用农杆菌转化法将该载体转入甘蔗品种ROC22中,获得了转SoACLA-1基因甘蔗无性系。本研究是以野生型甘蔗品种ROC22和上述转基因甘蔗品系的T1、T2代作为材料,研究过量表达SoACLA-1基因在干旱胁迫和复水时对甘蔗相关生理生化指标的影响以及在不同胁迫天数下SoACLA-1基因和几个响应植物干旱胁迫的基因的表达情况,为评价转SoACLA-1基因甘蔗的遗传稳定性及验证SoACLA-1基因的功能提供参考。研究内容及结果如下:1.导入的SoACLA-1基因在T1、T2代转基因甘蔗中均发现有丢失现象。利用PCR扩增标记基因bar基因并测序,结果表明31个阳性转基因甘蔗品系在T1代中有25个品系能检测到bar基因,而在T2代中则有21个品系能检测到bar基因,即T1代的转基因阳性率为80.6%,T2代的转基因阳性率为84%。2.RT-PCR及抗除草剂筛选进一步验证了转基因甘蔗材料。利用RT-PCR对转SoACLA-1基因甘蔗进行检测,结果表明导入的SoACLA-1基因能在mRNA水平上高效表达。经过除草剂抗性筛选发现,带有标记基因bar基因的转SoACLA-1基因甘蔗具有除草剂抗性。3.SoACLA-1基因能够提高T1代转基因甘蔗的抗旱性。在甘蔗伸长初期对转SoACLA-1基因甘蔗RT1、RT2、RT3、RT4和野生型甘蔗(WT)进行0、3、6、9 d和复水3 d的干旱胁迫处理并利用模糊数学中的隶属函数对叶绿素、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量等与抗旱性相关的4个指标进行综合评价,结果表明,5个甘蔗品系T1代抗旱性由强到弱依次为RT2RT4RT3RT1WT,旱后恢复能力由强到弱依次为RT1RT2RT4RT3WT;转基因甘蔗品系RT2的SOD活性在整个干旱胁迫及复水过程中均维持在高于其他几个转基因品系及WT的水平,从POD活性来看,整个干旱胁迫过程转基因品系RT4的POD活性均高于其他几个品系,而RT2的POD活性在胁迫中后期升幅较大并显著高于WT(P0.05)。在胁迫9d时,转基因品系的SoACLA-1基因表达量均高于WT。4.SoACLA-1基因能够提高T2代转基因甘蔗的抗旱性且SoACLA-1在转基因甘蔗中的胁迫诱导表达导致响应植物干旱胁迫的基因的上调。在甘蔗伸长末期对转SoACLA-1基因甘蔗RT2、RT4品系和野生型甘蔗(WT)进行干旱胁迫和复水处理,分别在干旱胁迫0、6、9 d和复水3d采集叶片进行分析,并利用模糊数学中的隶属函数对叶绿素、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量等与抗旱性相关的4个指标进行综合评价,结果表明,3个甘蔗品系的T2代抗旱性由强到弱依次为RT4RT2WT,旱后恢复能力由强到弱依次为RT2RT4WT;转基因甘蔗品系RT2的SOD活性在干旱胁迫9 d和复水3 d时显著高于WT,而RT2和RT4的POD活性在胁迫9 d均表现为显著高于WT。从实时荧光定量PCR的结果来看,SoACLA-1基因和SCDR4基因在胁迫6 d时的表达量最高,且RT2与RT4在此时的SoACLA-1基因和SCDR4基因的表达量均显著高于WT;P5CS基因与dhy基因的表达量则是在胁迫9 d时最高,且RT2与RT4此时的dhy基因显著高于WT,而RT2的P5CS基因表达量在胁迫9 d时显著高于WT。RT2品系的Cu/Zn-SOD基因表达量在胁迫6 d时高于WT,而RT4品系则是在9d是显著高于WT。可见,转SoACLA-1基因甘蔗T2代干旱胁迫后的生理生化指标的变化与几个响应干旱胁迫的基因表达具有一定的相关性。5.综合分析T1、T2代甘蔗的遗传稳定性及SoACLA-1基因的功能,得出SoACLA-1基因在甘蔗中虽有丢失现象,但随着代数的增加可能会趋于稳定,转基因甘蔗能够稳定高效地表达bar基因和SoACLA-1基因,目标性状在T1、T2代中均得以表现说明其目标性状也能稳定遗传,转基因甘蔗的抗旱性强于非转基因甘蔗证明Soo4CLA-1基因具有提高抗旱性的功能。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S566.1
【部分图文】：

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?ｓｔｒａｉｎｓ．??２．３．２转Ｓ＾ＣＵ－７基因甘蔗的ＲＴ－ＰＣＲ检测结果??用１．０％的琼脂凝胶电泳检测所提取的甘蔗叶片总ＲＮＡ，结果显示（图２－２ａ）所提??取的ＲＮＡ具备完整的三条带，从上往下依次为２８ＳＲＮＡ、１８ＳＲＮＡ和５ＳＲＮＡ、２８Ｓ??与１８Ｓ的条带亮度比约为２：１，且用Ｉｍｐｌｅｎ?Ｐ３００?ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ微量分光光度计测得??的ＲＮＡ浓度５００－７００?ｎｇ／ｎＬ之间，ＯＤ２６Ｑ／ＯＤ２８（）比值１．８－２．０之间，说明所提ＲＮＡ纯度??较高，无蛋白质残留。〇Ｄ２６０／ＯＤ２３ｆｌ则是在２－２．２之间说明无盐类物质污染。即ＲＮＡ样??品质量纯度等均符合下一步实验的要求。??１４?

?甘廉Ｓｏ／ｌＧＬ／ｉ－／基因遗Ｔ６？提定性分析及功能验证??当转基因甘蔗和野生型甘蔗在含有２．５?ｍｇ／Ｌ草甘磷的分化培养基和含有２．５?ｍｇ／Ｌ??草甘磷的生根培养基上分别生长１５ｄ?（图２－３ａ）和３０ｄ?（图２－３ｂ）后，转基因甘蔗大部??分叶片仍为绿色且继续生长，而野生型甘蔗己完全枯萎变黄。用１％的草甘膦浸泡甘蔗??叶片时发现，当浸泡１０?ｄ后，结果如图２－３ｃ所示，野生型甘蔗叶片变黄程度均比转基??因叶片严重。从以上结果可知，转基因甘蔗具有抗草甘膦的特性，即载体上的标记基因??ｔｏｒ基因存在于转基因甘蔗中

３．４结果与分析??３．４．１干旱胁迫下甘蔗植株的形态变化??由图３－ｌａ可看出，在干旱胁迫开始前，甘蔗植株生长正常，胁迫至６ｄ时各甘蔗植??株的叶片开始变黄并下垂（图３－ｌｂ）；经过了?９?ｄ的水分胁迫后，所有植株的叶片明显??枯黄萎缩，此时的水分胁迫程度己严重影响了甘蔗的生长（图３－ｌｃ）。然而在干旱胁迫??的整个过程中，各转基因甘蔗品系与ＷＴ的外在形态变化并无明显差异。??ｌｉｆｔ??ａ?ｂｅ??图３－１?ＴＶ胁迫下甘蔗植株的形态变化??ａ：下￥胁迫０ｄ甘蔗生长状况；ｂ：?Ｔ￥胁迫６?ｄ甘蔗生长状况；ｃ：?ＴＶ胁迫９?ｄ甘蔗生长状况??Ｆｉｇ．?３－１?Ｍｏｉｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｃｈａｎｇｅｓ?ｏｆ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?ｕｎｄｅｒ?ｄｒｏｕｇｈｔ?ｓｔｒｅｓｓ??ａ：?Ｇｒｏｗｔｈ?ｓｔａｔｕｓ?ｏｆ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?ｂｅｆｏｒｅ?ｄｒｏｕｇｈｔ?ｓｔｒｅｓｓ；?ｂ：?Ｇｒｏｗｔｈ?ｓｔａｔｕｓ?ｏｆ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?ｕｎ
【参考文献】

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本文编号：2873274