γ-氨基丁酸（GABA）在棉花低氮胁迫响应中的功能研究
发布时间：2020-11-14 21:13
氮是植物体内蛋白质、磷脂、核酸、激素、维生素,以及一些辅酶、辅基等物质的主要组分,对植物的生长发育进程有重要作用。它还是植物叶绿素的重要组成元素,可以影响植物的光合速率。不仅如此,氮营养水平可以改变植物体内的氮-碳平衡,对作物最终产量的贡献约为45%。而且,低氮条件还可以影响生长素合成基因(TAR2)、植物激素运输相关基因的表达水平,这将改变生长素等在根中的积累量,从而促进植物侧根的发育,增加植物对氮营养的吸收效率。棉花是一种对氮肥敏感的植物,其产量的提高主要靠施用大量的氮肥。然而,棉花对氮肥的利用率低,尤其是我国。大量施氮不仅不能被植物吸收,还会造成土壤板结,进一步降低氮肥的吸收效率,从而使水土富营养化,影响生态平衡。因此,“少施肥,高产棉”就成为棉花栽培与育种生理学的研究热点。γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳的非蛋白质氨基酸,对植物多种逆境胁迫,如酸碱胁迫、低温、热刺激、高盐、机械损伤等均产生响应;其本身亦可作为氮源发挥作用,通过GABA支路调节氮-碳平衡。本论文从外源添加和内源途径改变植物体内GABA含量,探究GABA在棉花低氮胁迫中的作用,主要研究结果如下:1、低氮胁迫对棉花GABA水平的影响低氮处理海岛棉8 d,检测根系GABA含量,发现‘XH12’品种GABA含量由正常处理组的4.21μg/g(FW)显著上升到5.43μg/g(FW);‘XH21’品种同样由正常处理组的4.67μg/g(FW)显著上升到5.60μg/g(FW);并且,冀棉14在遭受低氮胁迫14 d后,相较于正常供氮水平,其根中GABA含量由2.47μg/g(FW)增加到6.11μg/g(FW);低氮处理29 d后,GABA含量由2.87μg/g(FW)增加到4.47μg/g(FW)。再者,对T_4代GhPOP2(pollen pistil interaction)转基因棉花低氮处理14 d,检测GABA含量发现,无论上调还是下调GhPOP2转录水平,GABA含量在低氮条件下均显著升高。以上结果表明,棉花在遭受低氮胁迫时,会诱导内源GABA含量显著上升,这可能为棉花提供更多的氮源物质,从而提高其对低氮胁迫的耐受力。2、低氮胁迫棉花的转录组分析对不同氮营养利用效率的海岛棉和陆地棉进行低氮处理,转录组测序结果显示,在新陆早和新海棉花品种中分别发现3598、1801个基因转录水平有显著差异;低氮处理下,氮低效品种相比于氮高效品种,显著差异的基因有433个,当中有271个基因显著上调,162个基因显著下调;标氮处理下,氮低效品种相比于氮高效品种,显著差异的基因有15个,当中8个基因显著上调,7个基因显著下调。进一步对低氮处理的海岛棉和陆地棉进行KEGG富集分析发现,这些差异基因主要富集在谷氨酸代谢、激素信号转导,以及类胡萝卜素生物合成等途径。GABA与谷氨酸代谢密切相关,而GhPOP2基因编码的GABA-T是GABA降解代谢的首要限速酶。检索转录组中GhPOP2基因的转录水平,发现低氮胁迫下,陆地棉和海岛棉根中GhPOP2基因的表达水平升高;而GAD的表达水平在陆地棉中上调,海岛棉中却下调。这可能是海岛棉和陆地棉品种在低氮胁迫下对谷氨酸的需求存在差异所致。3、低氮胁迫对棉花中GhPOP2转录水平的影响GhPOP2基因启动子在棉花的各部位均有表达,但它主要在花瓣、雄蕊、柱头、胚珠等生殖器官中表达。研究发现,野生型棉花低氮处理后,根和子叶GhPOP2表达量相比于对照组显著升高;对冀棉14进行不同时间的低氮处理,通过RT-PCR检测GhPOP2表达量,发现其在根系表达水平首先升高,然后信号依次向下胚轴、子叶传导;另外,对转入P_(GhPOP2)::GUS的转基因棉花进行低氮处理,组织化学染色显示,低氮处理7 d的植株,相比于未处理对照组GUS信号明显加强,且其叶片的保卫细胞也出现了GUS信号,这暗示GABA代谢过程参与了植物对低氮胁迫的响应;同时转入P_(GhPOP2)::GUS转基因拟南芥低氮处理后,GUS信号也在其根尖增强。这些结果初步表明,低氮胁迫可以诱导GhPOP2基因的表达,这种诱导作用在根中更明显。为了更好地了解GhPOP2基因的功能,构建了pLGN-35S-GhPOP2::GFP表达载体,在烟草叶片中进行瞬时表达,与线粒体marker共定位后发现,GhPOP2基因定位在线粒体上。4、超量表达GhPOP2基因增加棉花植株对低氮胁迫的耐受性为通过分子手段调控棉花内源GABA含量,构建了GhPOP2的超量、反义、干扰植物表达载体,对棉花进行遗传转化,筛选得到相应的转基因植株。检测转基因植株中GABA含量发现,超表达GhPOP2使GABA含量降低,反义和干扰植株GABA含量则升高。对低氮处理的GhPOP2转基因植株的表型观察发现,超量植株对氮胁迫的耐受力要明显高于野生型和反义植株,在野生型和反义植株叶片均明显发黄、脱落的情况下,超表达植株仍是正常的叶片表型。其原因可能是超表达GhPOP2加大了GABA的降解水平,从而为植物提供所需的氮源。这使植株叶绿素含量升高,并促进了其光合速率的增强;而下调GhPOP2的表达量则是相反的结果。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S562
【部分图文】：
西南大学硕士学位论文透强度、信号传导(Fait et al., 2008)、调控植物的生长发育进程(Akihiro et al., 2008)，以及调控拟南芥的受精作用(Renault et al., 2011)等。由此可见，GABA 对动物、植物和微生物都是一种重要的生理活性物质，对它的深入研究是极有必要的。1.2.2 植物体内 GABA 的合成代谢在细菌和哺乳动物中的研究发现，细胞质中的 GABA 是由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase, GAD）的催化下生成，再在 GABA 转氨酶（γ-Aminobutyrate transaminase, GABA-T）的催化下，与 α–酮戊二酸发生转氨基作用生成谷氨酸（Glu）和琥珀酸半醛（SSA）；琥珀酸半醛又在琥珀酸半醛脱氢酶（succinate semialehyde dehydrogenase, SSADH）的催化下被氧化，生成琥珀酸进入三羧酸循环（tricarboxylic-acid, TCA），为 TCA 循环提供所需的碳源。以上的从 α-酮戊二酸生成谷氨酸又脱羧生成 GABA,直到 GABA 降解，最终生成琥珀酸这一途径被称为 GABA 支路（图 1.1）(Barry et al., 1997)。
图 4.1 不同氮效棉花品种中基因表达量差异火山图和维恩图Figure 4.1 Difference in gene expression of cotton with different nitrogen efficiency Volcanoplots and Venn diagramsHE:High-NUE cultivar(NUE: Nitrogen use efficiency),氮高效利用；LE: Low-NUE cultivar,氮低效利用；NN(Normal Nitrogen)=5 mmol/L NO3-, LN(Low Nitrogen)=0.1 mmol/L NO3-; （A）低氮处理下差异基因火山图：横坐标为处理样的表达量/对照样的表达量，纵坐标为基因表达量变化差异的统计学检验值，该值越高表明表达差异越显著；（B）标氮处理下差异基因火山图；（C）每个大圈中数字之和表示该组差异基因总个数，圆圈交叉部分表示两组间共有的表达基因，以 fpkm>2 为基因表达的标准。(A) Differential gene volcano plots under low nitrogen treatment: the abscissa is the expression level of thetreated sample/the expression level of the control, and the ordinate is the statistical test value of the difference inthe expression level of the gene. The higher the value is, the more significant the expression difference is. (B)Differential gene volcano map under standard nitrogen treatment. (C) The sum of the numbers in each large circleindicates the total number of differential genes in the group, and the circled cross indicates the genes commonlyexpressed between the two groups. The fpkm>2 is the standard for gene expression.
29图 4.2 低氮处理下基因表达量差异散点图和维恩图Figure 4.2 The Scatter and Venn diagram of gene expression differences under low nitrogentreatmentGh: Gossypium hirsutum 陆地棉；Gb:Gossypium barbadense 海岛棉；NN(Normal Nitrogen)=5 mmol/L NO3-,LN(Low Nitrogen)=0.1 mmol/L NO3-; Dn：down 下调；Up: 上调；（A）低氮胁迫下陆地棉基因表达量差异散点图：横坐标值为该基因在对照样中的表达量，每个点代表一个特定的基因，纵坐标值为该基因在处理样中的表达量；（B）低氮胁迫下海岛棉基因表达量差异散点图；（C）低氮下，陆地棉、海岛棉显著性差异基因分别上调、下调的维恩图。(A) The Scatter diagram of gene expression differences under low nitrogen treatment in Gh: The abscissa value isthe amount of expression of the gene in the control. Each point represents a specific gene. The ordinate value is theexpression level of the gene in the treated sample. (B) The Scatter diagram of gene expression differences underlow nitrogen stress treatment in Gb. (C) The Venn diagram of gene expression differences under low nitrogenstress treatment in Gh and Gb.
【参考文献】
本文编号：2883958
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S562
【部分图文】：
西南大学硕士学位论文透强度、信号传导(Fait et al., 2008)、调控植物的生长发育进程(Akihiro et al., 2008)，以及调控拟南芥的受精作用(Renault et al., 2011)等。由此可见，GABA 对动物、植物和微生物都是一种重要的生理活性物质，对它的深入研究是极有必要的。1.2.2 植物体内 GABA 的合成代谢在细菌和哺乳动物中的研究发现，细胞质中的 GABA 是由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase, GAD）的催化下生成，再在 GABA 转氨酶（γ-Aminobutyrate transaminase, GABA-T）的催化下，与 α–酮戊二酸发生转氨基作用生成谷氨酸（Glu）和琥珀酸半醛（SSA）；琥珀酸半醛又在琥珀酸半醛脱氢酶（succinate semialehyde dehydrogenase, SSADH）的催化下被氧化，生成琥珀酸进入三羧酸循环（tricarboxylic-acid, TCA），为 TCA 循环提供所需的碳源。以上的从 α-酮戊二酸生成谷氨酸又脱羧生成 GABA,直到 GABA 降解，最终生成琥珀酸这一途径被称为 GABA 支路（图 1.1）(Barry et al., 1997)。
图 4.1 不同氮效棉花品种中基因表达量差异火山图和维恩图Figure 4.1 Difference in gene expression of cotton with different nitrogen efficiency Volcanoplots and Venn diagramsHE:High-NUE cultivar(NUE: Nitrogen use efficiency),氮高效利用；LE: Low-NUE cultivar,氮低效利用；NN(Normal Nitrogen)=5 mmol/L NO3-, LN(Low Nitrogen)=0.1 mmol/L NO3-; （A）低氮处理下差异基因火山图：横坐标为处理样的表达量/对照样的表达量，纵坐标为基因表达量变化差异的统计学检验值，该值越高表明表达差异越显著；（B）标氮处理下差异基因火山图；（C）每个大圈中数字之和表示该组差异基因总个数，圆圈交叉部分表示两组间共有的表达基因，以 fpkm>2 为基因表达的标准。(A) Differential gene volcano plots under low nitrogen treatment: the abscissa is the expression level of thetreated sample/the expression level of the control, and the ordinate is the statistical test value of the difference inthe expression level of the gene. The higher the value is, the more significant the expression difference is. (B)Differential gene volcano map under standard nitrogen treatment. (C) The sum of the numbers in each large circleindicates the total number of differential genes in the group, and the circled cross indicates the genes commonlyexpressed between the two groups. The fpkm>2 is the standard for gene expression.
29图 4.2 低氮处理下基因表达量差异散点图和维恩图Figure 4.2 The Scatter and Venn diagram of gene expression differences under low nitrogentreatmentGh: Gossypium hirsutum 陆地棉；Gb:Gossypium barbadense 海岛棉；NN(Normal Nitrogen)=5 mmol/L NO3-,LN(Low Nitrogen)=0.1 mmol/L NO3-; Dn：down 下调；Up: 上调；（A）低氮胁迫下陆地棉基因表达量差异散点图：横坐标值为该基因在对照样中的表达量，每个点代表一个特定的基因，纵坐标值为该基因在处理样中的表达量；（B）低氮胁迫下海岛棉基因表达量差异散点图；（C）低氮下，陆地棉、海岛棉显著性差异基因分别上调、下调的维恩图。(A) The Scatter diagram of gene expression differences under low nitrogen treatment in Gh: The abscissa value isthe amount of expression of the gene in the control. Each point represents a specific gene. The ordinate value is theexpression level of the gene in the treated sample. (B) The Scatter diagram of gene expression differences underlow nitrogen stress treatment in Gb. (C) The Venn diagram of gene expression differences under low nitrogenstress treatment in Gh and Gb.
【参考文献】
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本文编号：2883958
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