NPR1基因介导的麦类作物获得抗性转录调控网络研究

发布时间：2020-11-15 02:57

　　 植物受病原菌或水杨酸及其类似物诱导,会产生具有广谱抗性特征的系统获得抗性。NPR1蛋白和WRKY转录因子是植物SAR过程关键转录调控位点。在大麦和小麦等麦类作物中,可在注射丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000的相邻区观察到与模式植物SAR类似的“获得抗性(Acquired Resistance,AR)”。然而,麦类作物AR的转录调控网络及NPR1基因的功能仍亟待明确。本研究主要研究内容及结果如下:利用丁香假单胞菌DC3000诱导小麦产生AR反应,在DC3000接种相邻区可有效地增强小麦对叶锈菌(Puccinia triticina,Pt)高毒性小种THTT的抗性水平。利用丁香假单胞菌DC3000诱导大麦转基因材料Ubi::wNPR1和Ubi::HvNPR1-Kd产生AR反应,以稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株Guy11为二次病原物侵染测定AR水平。结果表明,大麦转基因材料Ubi::wNPR1表现出对稻瘟菌菌株Guy11的抗性水平显著提高,而Ubi::HvNPR1-Kd材料中的AR被明显抑制。进一步利用RNA-seq技术,测定了上述材料在AR过程中的差异表达基因。通过生物信息学分析,推测一些病程相关PR基因和BTH处理诱导的BCI基因在AR过程中受NPR1基因调控。利用荧光实时定量qRT-PCR技术,对部分基因表达量进行验证。从全基因组水平分析了WRKY转录因子基因家族的表达模式,发现并克隆了10个差异表达WRKY基因。利用农杆菌介导的基因瞬时表达技术,发现其中3个WRKY基因,包括HvWRKY6、HvWRKY40和HvWRKY70可显著增强小麦对叶锈菌的抗病水平。本研究初步构建了NPR1基因在麦类作物AR过程中的转录调控网络,明确了该生物学过程在作物抗病遗传改良方面的应用前景。生物信息学分析发现的差异表达基因及关键WRKY转录因子,将为提高小麦抗病水平提供新思路及创新性种质资源。
【学位单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S512.1
【部分图文】：

河北农业大学硕士学位（毕业）论文3 结果与分析菌 DC3000 引起的 AR 反应可增强小麦病材料“Thatcher”苗期第二叶叶尖注射丁香。以清水注射作为对照，注射 DC3000 后 48 h接种小麦叶锈菌毒性小种 THTT。于接种后 1占叶片面积的百分比，实验设置两次系统重复复，利用 SAS 软件进行差异显著性分析。结 AR 反应可显著（***P < 0.0001）增强小清水对照孢子堆数量明显减少（图 1）。

NPR1 基因介导的麦类作物获得抗性转录调控网络研究稻瘟菌菌株 Guy11，设置 6 个生物学重复。接种稻瘟菌 5 d 后测量病斑大小。结果图 2 所示，在大麦野生型材料中可观察到明显的对稻瘟菌 Guy11 的 AR 反应。而在水处理中，wNPR1-OE 转基因材料相对于野生型材料对 Guy11 表现出更强的抗性平，证明在不需要丁香假单胞菌 DC3000 诱导下，wNPR1-OE 材料也可以增强对稻菌菌株 Guy11 的抗性。而 DC3000 处理条件下，HvNPR1-Kd 转基因材料相对于野型，可明显观察到 AR 反应被抑制。上述结果表明，NPR1 基因在丁香假单胞菌3000 引起的 AR 反应中起关键作用。

图 3 RNA-seq 生物学重复间的 Pearson’s 相关性 （R2> 0.92）CK：清水对照； PST：P. syringae DC3000 处理；OE：小麦 NPR1 过表达； Kd：大麦 NPR1 沉默Fig.3 Pearson’s correlation of biological replicates in the present RNA-seq assay （R2> 0.92）CK: water infiltration control; PST: P. syringae DC3000 infiltration;OE: wNPR1-OE transgenic line; Kd: HvNPR1-Kd transgenic line PR 基因和 BCI 基因在 NPR1 介导的大麦 AR 中的表达谱在本课题组前期研究中，利用荧光实时定量 qRT-PCR 技术，多个病程相关 PR因被证实为 AR 过程中 NPR1 的下游基因[44]。本研究中，我们整理了所有已知 PR因在 RNA-seq 数据库中的表达谱，利用 MeV 软件对 PR 基因在数据库中的 FPKM做热图，其中 HvPR1、HvPR2、HvPR3_Chit2a、HvPR5_TLP6/7/8、HvPR9 和 HvPR13导水平与 NPR1 转基因表达量显著（P < 0.05）相关，表现为在 wNPR1-OE 转基因料中更高或在 HvNPR1-Kd 转基因材料中更低（如图 4 所示）。而 HvPR5_TLP1、PR15、HvPR16、HvPR17a 和 HvPR17b 表达水平受丁香假单胞菌 DC3000 显著诱，但诱导水平与 NPR1 转基因表达量无关。我们同样对另一类大麦中 SA/BTH 敏感 BCI 基因，进行了表达谱分析。结果表明，HvBCI2 基因和 HvBCI7/HvPR13 基因
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本文编号：2884261