萌发藜麦酸性蛋白酶酶学分析和生产条件优化

发布时间：2020-11-15 08:52

　　 藜麦(Chenopodium quinoa Willd)是一种单体植物即可满足人体基本营养需求的食物,被联合国粮农组织推荐藜麦为最适宜人类的营养食品。藜麦不仅仅富含多种人类所需的营养素,而且藜麦是少有的拥有着接近人体氨基酸构成的植物。目前藜麦的被广泛应用在食品、饲料和农业领域。植源性蛋白酶一般拥有天然无害、催化活力高等特点,在保健食品、化妆品、医药、日常生活用品等领域被广泛应用。藜麦拥有着动物才具有的完全蛋白,蛋白组成成分在植物中十分罕见,所以它的蛋白酶具有着巨大的开发潜力和研究价值。本研究以萌发藜麦为研究对象,对萌发藜麦中蛋白酶的酸碱性质、分离纯化方法、酶学性质、提取工艺和培养条件等方面进行了初步研究,论文的主要研究成果如下:(1)为了探讨不同种浸提溶剂对酶活力的影响程度。本实验利用去离子水、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液提取萌发藜麦蛋白酶,对于萌发藜麦蛋白酶来讲,磷酸盐缓冲液对其浸提效果最为突出,而去离子水对其浸提效果最差,说明适宜的无机盐浓度有利于藜麦蛋白酶的提取。在此基础上,利用不同酸碱性的底物检测萌发藜麦蛋白酶的蛋白酶活力,得出萌发藜麦蛋白酶在pH值为3的反应条件下酶活力最高,是一种酸性蛋白酶。比较了(NH_4)_2SO_4盐析法和等电点沉淀法对萌发藜麦中所含的蛋白酶的提纯效果,(NH_4)_2SO_4盐析法和等电点沉淀法提取萌发藜麦蛋白酶的酶活回收率分别为40.36%和45.30%,比活力分别为4.78 U/mg和5.23 U/mg。所以,优选等电点沉淀法从藜麦浸提液种提纯萌发藜麦蛋白酶。(2)在提纯出萌发藜麦蛋白酶粗酶的基础上,将粗酶液通过HiPrep?Q XL 16/10阴离子交换柱纯化,纯化效果较理想,使酶的比活力提升到24.74 U/mg,回收率为15.65%,纯化倍数为12.07倍。对纯化后的蛋白酶进行电泳分析,结果表明经阴离子纯化后的酶液显示单一条带,萌发藜麦蛋白酶的分子量约为55kDa。(3)萌发藜麦蛋白酶酶学性质的结果表明,该酶的最适pH为3,最适温度是60℃,该酶的温度稳定性和pH稳定性不强。在金属离子方面,Cu~(2+)和K~+对该蛋白酶有轻微的激活作用,Mn~(2+)激活作用最强,而Zn~(2+)和Fe~(2+)对酶活力有抑制作用。蛋白酶抑制剂方面研究结果表示,天冬氨酸蛋白酶抑制剂基本抑制了萌发藜麦酸性蛋白酶的酶活力,因此,萌发藜麦酸性蛋白酶极有可能是一种天冬氨酸蛋白酶。酶促反应动力学研究表明,在以酪蛋白为底物时,酶对底物的Vmax=0.285 mg/min,Km=3.52 mM。(4)本实验以萌发藜麦为原料,乳酸盐缓冲液为提取溶剂。进一步对提取pH、提取料液比和浸提时间进行单因素实验。为了使实验结果更加科学准确,进行了3因素3水平的正交实验。萌发藜麦蛋白酶活力为指标,优化了萌发藜麦的提取参数,得出提取萌发藜麦蛋白酶的最佳工艺参数是萌发藜麦以料液比为1:6在pH为7.0的缓冲液中充分匀浆,匀浆后4℃浸提30 min。(5)在此基础上,以萌发藜麦蛋白酶活力为指标,本实验还对藜麦的萌发时间、萌发温度、萌发相对湿度进行了单因素实验。为了使实验结果更加科学准确,进行了3因素3水平的正交实验。以萌发藜麦蛋白酶活力为指标,优化了藜麦的萌发条件,即藜麦种子在环境温度为25℃、环境相对湿度为60%萌发18 h时所产生的萌发藜麦酸性蛋白酶活力最高。(6)通过生物信息学手段,预测了藜麦天冬氨酸蛋白酶的分子量大小为54.993 kDa,理论等电点为4.56,脂溶性参数为84.80,总的亲水性平均系数为0.002,糖基化位点分析结果表明,藜麦天冬氨酸蛋白酶不存在N-糖基化位点。并预测了该酶在藜麦中的位置(液泡),预测了藜麦天冬氨酸蛋白酶存在两个酶活性位点Asp~(94)、Asp~(277),并预测了它的3D结构。成功将携带藜麦天冬氨酸蛋白酶的质粒转入大肠杆菌宿主中,并分析了藜麦蛋白酶未能表达的原因。
【学位单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S519
【部分图文】：

第二章 萌发藜麦酸性蛋白酶的分离纯化0 1 2 3 标准牛血清蛋白溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0去离子水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0当于蛋白质含量/ug 0 20 40 60 8论白标准曲线的绘制血清蛋白浓度为横坐标，595 nm 处 OD 值为纵坐标，绘如图 2.1 所示。

Proteinase剂 去离子水 Tris-HCl 缓冲液 磷酸 pH 7.0 7.0 U 191.2 257 于萌发藜麦芽的蛋白酶来讲，提取效果为磷酸盐缓冲液>水，因此实验选用磷酸盐缓冲液提取萌发藜麦蛋白酶的沉淀法纯化萌发藜麦蛋白酶沉淀法可以从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质，由数小、很难导致溶液中的蛋白质变性，被广泛用于酶的分增加时，蛋白酶在上清液中的溶解度降低，当盐浓度过高因此需要结合适当的盐浓度来纯化蛋白酶。经硫酸铵沉淀法处理后收集到的藜麦蛋白酶总活力为指标度，结果如图 2.3 所示。

齐鲁工业大学硕士学位论文的(NH4)2SO4沉淀巴西松子蛋白酶结果相似，而张培[66]等蛋白酶的最佳硫酸铵饱和度为 55 %。这说同种中性盐对影响程度不同，从而导致了蛋白酶在中性盐溶液中的溶点沉淀法萌发藜麦蛋白酶多数植物蛋白的等电点都处在酸性或弱酸性范围，通过等去除藜麦粗提液中的杂蛋白，从而达到提纯蛋白酶液的目H 在 3-6 范围内的处理情况，以上清液中萌发藜麦蛋白酶评估萌发藜麦蛋白酶等电点沉淀法纯化结果。
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本文编号：2884576