应用代谢组学对比研究两种黄芪响应UV-B和干旱胁迫的代谢基础

发布时间：2020-11-19 00:27

　　 黄芪作为一种享誉国际的中药材,传统的来源是蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus Bge.var.mongholicus Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)的干燥根。长期以来,这两种源植物都被作为同一种原料通用,但目前对于蒙古黄芪和膜荚黄芪在化合物水平上的广泛研究尚不详尽,从代谢水平上综合寻找两者之间的差异有利于原料应用的区分,为黄芪药材的充分利用可以提供可靠的数据鉴定。全球当前的环境现状,降临到地球表面的UV-B辐射(280-320nm)可能会逐年增加,UV-B辐射可以诱导植物的光生物胁迫,激活植物防御系统并诱导代谢的变化,进而影响黄芪药材的代谢产物和化学成分。在这个前提下,对于这两种黄芪植物的UV-B胁迫代谢响应的比较研究值得深入。与此同时,蒙古黄芪作为一种旱中生植物,有比中生植物膜荚黄芪更优秀的干旱耐受性,这是植物与生长环境相互作用的结果。这种耐受性差异的原因与植物代谢是否有关,两种黄芪生长环境的差异是否会对植物代谢产生不同的影响,进而影响黄芪药材的成分和质量?本研究以传统黄芪药材的源植物蒙古黄芪和膜荚黄芪植株为材料,基于非靶向GC-MS和靶向UPLC-q/tof-MS代谢组学技术平台,结合生理生态学指标,主要从以下几个方面对两种黄芪的品种及组织特异性代谢特征、二者响应UV-B胁迫和干旱胁迫的生理和代谢差异进行了探索研究:(1)利用GC-MS非靶向代谢组学技术对蒙古黄芪和膜荚黄芪根和叶片进行全面的分析,最终鉴定出144种初级代谢产物。运用多元统计分析方法,建立偏最小二乘法(PLS-DA)模型,对蒙古黄芪和膜荚黄芪品种特异性及组织特异性进行分析,最终共鉴定15种显著差异化合物,其分别为VIP1和p0.05。通过LC-MS对样品进行酚类化合物的靶向分析,根据标准对照物质的质谱信息和保留时间进行目标化合物的鉴定,最终共鉴定了 28种酚类代谢物。以及1种关键化合物L-苯丙氨酸。这些酚类代谢物参与黄酮和黄酮醇,类黄酮,苯丙素,泛醌,其他萜类醌和植物激素的生物合成以及苯丙氨酸的代谢。为了更详细地了解蒙古黄芪和膜荚黄芪每个组织中己鉴定代谢物的相似性或差异,我们建立了一个初级代谢和酚类代谢互作网络。无论初级代谢还是酚类代谢在蒙古黄芪和膜荚黄芪的组织中均存在显著的差异。因此,蒙古黄芪和膜荚黄芪在药材方面应该做好区分,而不能作为同一种药材通用。(2)考察了两种黄芪在UV-B胁迫下的叶绿素、过氧化氢含量及四种抗氧化酶的酶活性,发现蒙古黄芪中四种抗氧化酶活性都有显著上升,而膜荚黄芪中部分抗氧化酶活性有所下降,得知同等的UV-B辐射胁迫条件下,蒙古黄芪抵抗和防御UV-B损伤的能力优于膜荚黄芪。通过GC-MS非靶向代谢组分析,根据较多糖类化合物在两种黄芪根部组织显著增加积累的现象,得知两种黄芪在UV-B胁迫下都表现出了生长能量从地上组织向地下组织的转移。通过LC-MS靶向代谢组分析,发现蒙古黄芪中,C6C3C6碳骨架化合物以C6C3化合物为代价在UV-B胁迫下更多的积累;而膜荚黄芪中的代谢模式与此相反。我们认为这种相反的代谢模式可能也是导致两种黄芪UV-B抵抗力差异的原因之一。(3)通过代谢物与抗氧化酶的相关性分析,发现初级代谢物:α-D-吡喃葡萄糖苷(α-D-Glucopyranoside)、L-苏糖酸(L-Threonic acid)、丁酸(Butanoic acid)和酚类代谢物:毛蕊异黄酮苷(Calycosin-7-glucoside)、毛蕊异黄酮(Calycosin)、芒柄花苷(Ononin)都与过氧化物酶呈显著正相关。有趣的是,UV-B胁迫下,这些化合物在蒙古黄芪中增加而在膜荚黄芪中减少,由此认为蒙古黄芪中的这些化合物对抗氧化系统的贡献和补充更大,这些化合物的代谢差异也因此成为两种黄芪UV-B抵抗力差异的重要原因之一。(4)通过考察光合特性,抗氧化酶和渗透调节,在叶和根中研究了干旱适应特征,结果表明,在渐进式的干旱胁迫下,蒙古黄芪在维持光合作用和激活抗氧化酶系统方面优于膜荚黄芪。由此证明,作为旱中生植物的蒙古黄芪确实比中生植物的膜荚黄芪有更好的干旱耐受性。通过非靶向气相色谱-质谱联用GC-MS代谢组学技术,发现在干旱胁迫下,蔗糖,果糖和苹果酸仅在蒙古黄芪的叶片中作为显著差异代谢物出现;苹果酸和甘露糖仅在膜荚黄芪的叶片中显著增加,仅在蒙古黄芪中出现明显增强的蔗糖和肌醇(参与渗透调节和能量代谢)积累。这些响应于干旱的初级代谢物差异积累,可能是两种黄芪在干旱条件下的耐受性。运用靶向液相色谱-质谱联用LC-MS技术,发现在干旱进程中,异黄酮仅在两个黄芪品种的根中表现出显著的增加;酚酸类物质仅在蒙古黄芪的叶片中有显著的增加,而膜荚黄芪中黄酮醇类物质含量增加。这些酚类化合物和初级代谢物的差异代谢,可能也是两种黄芪干旱耐受性差异的原因之一。(5)通过代谢物与渗透调节剂和抗氧化酶的相关性分析,发现蔗糖和肌醇等部分初级代谢物与渗透调节剂显著正相关,而部分酚类化合物与抗氧化酶显著正相关,这意味着初级代谢产物和酚类化合物分别对植物干旱条件下的渗透调节和抗氧化能力有所贡献。这两种干旱耐受性不同的黄芪,在干旱胁迫下有非常明显的代谢差异,我们认为品种和组织特异性的代谢可能影响着蒙古黄芪和膜荚黄芪的干旱耐受性。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.239
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 黄芪的研究进展
        1.1.1 黄芪的本草考证
        1.1.2 黄芪属植物简介
        1.1.3 黄芪的生物学特性
        1.1.4 黄芪的化学成分研究
        1.1.5 黄芪的药理作用
        1.1.6 黄芪对逆境胁迫的响应
    1.2 UV-B辐射对植物的影响
        1.2.1 UV-B辐射研究方法
        1.2.2 UV-B辐射对植物形态学特征的影响
        1.2.3 UV-B辐射对植物光合作用的影响
        1.2.4 UV-B辐射对植物代谢的影响和植物保护机制
    1.3 干旱对植物的影响
        1.3.1 干旱胁迫的研究方法
        1.3.2 干旱胁迫对植物形态学特征的影响
        1.3.3 干旱胁迫对植物光合作用的影响
        1.3.4 干旱胁迫对植物代谢的影响和植物保护机制
    1.4 代谢组学的国内外研究进展及应用
        1.4.1 代谢组学的发展
        1.4.2 代谢组学分析方法及路线
        1.4.3 代谢组学在药用植物及物种鉴定中的应用
    1.5 初级代谢物在植物中的分布及其生物学功能
        1.5.1 初级代谢物在植物中的分布
        1.5.2 初级代谢物的生物学功能
    1.6 酚类在植物中的积累及其生物学功能
        1.6.1 酚类在植物中的分布
        1.6.2 酚类在植物中的积累模式
        1.6.3 酚类的生物学功能
    1.7 本课题研究目的与意义
2 蒙古黄芪和膜荚黄芪组织代谢多样性
    2.1 引言
    2.2 植物来源
    2.3 材料与方法
        2.3.1 仪器与材料
        2.3.2 实验方法
        2.3.3 数据分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 GC-MS鉴定的初级代谢物在蒙古黄芪和膜荚黄芪中的综合分布
        2.4.2 比较蒙古黄芪和膜荚黄芪差异代谢分析
        2.4.3 基于LC-MS靶向分析蒙古黄芪和膜荚黄芪中的酚类代谢物
        2.4.4 GC-MS和LC-MS构建两品种及组织特异性代谢网络的整合视图
    2.5 讨论
    2.6 本章小结
3 蒙古黄芪和膜荚黄芪对UV-B胁迫的代谢响应研究
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 仪器与材料
        3.2.2 实验方法
        3.2.3 数据分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 UV-B诱导的两种黄芪的形态变化和光合作用的比较分析
2O₂含量变化的比较分析'>        3.3.2 UV-B诱导的两种黄芪中抗氧化酶活性与H₂O₂含量变化的比较分析
        3.3.3 两种黄芪的初级代谢对UV-B响应的比较分析
        3.3.4 两种黄芪的酚类代谢物对UV-B响应的比较分析
        3.3.5 代谢物与抗氧化指标之间的相关性分析
    3.4 讨论
        3.4.1 两种黄芪在UV-B处理下的生理响应比较分析
        3.4.2 两种黄芪在UV-B处理下的代谢组学比较分析
    3.5 本章小结
4 蒙古黄芪和膜荚黄芪对干旱胁迫的代谢响应研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 仪器与材料
        4.2.2 实验方法
        4.2.3 数据分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 干旱胁迫诱导的两种黄芪的光合作用和脂质过氧化作用的比较分析
2O₂含量变化的比较分析'>        4.3.2 干旱胁迫下两种黄芪中抗氧化酶活性与H₂O₂含量变化的比较分析
        4.3.3 两种黄芪的初级代谢对干旱胁迫响应的比较分析
        4.3.4 两种黄芪的酚类代谢物对干旱胁迫响应的比较分析
        4.3.5 代谢物与耐受性指标之间的相关性分析
    4.4 讨论
        4.4.1 两种黄芪在干旱胁迫下的生理响应分析
        4.4.2 两种黄芪在干旱胁迫下的代谢比较分析
    4.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件

【参考文献】

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本文编号：2889425