百脉根种质评价、创制与LcSRA13耐盐调控机理研究

发布时间：2020-12-04 04:30

　　百脉根（Lotus corniculatus）营养丰富、品质优良,生态适应性广,可应用在畜牧业养殖、园林观赏和土壤生态修复等方面。土壤盐渍化是当前全球范围内所面对的生态问题,严重威胁农牧业的发展。培育百脉根耐盐新种质,并阐述逆境相关基因的调控机理,具有重要的理论意义及应用价值。AP2/ERF类转录因子参与植物逆境胁迫应答等多条代谢途径。本研究开展百脉根种质评价及系统进化分析,应用基因工程技术创制抗旱耐盐性增强的新种质,阐述百脉根AP2/ERF家族基因LcSRA13参与植物分枝和盐胁迫应答的分子调控途径。主要研究结果如下:1.评价了来源于世界各地的215份百脉根种质资源的形态指标和农艺性状及变异系数,鉴定了百脉根种质具有丰富的形态多样性,根据ITS序列构建了系统进化树分析亲缘关系,并推测出百脉根从地中海起源后首先疏散到欧洲大陆,随后传播到北美洲,俄罗斯,西亚。2.应用农杆菌介导法转化具有PeDREB和KcERF的双价植物表达载体,创制了百脉根新种质。通过胁迫下抗逆表型、组织含水量、细胞膜伤害、代谢类物质含量变化等相关生理生化指标的测定,共表达PeDREB和KcERF的百脉根植株抗旱耐盐性... 

【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：108 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
第二章 文献综述
    2.1 百脉根分子生物学研究进展
        2.1.1 百脉根的应用领域
        2.1.2 百脉根资源评价
        2.1.3 百脉根分子生物学研究进展
    2.2 AP2/ERF类转录因子分子调控机理
        2.2.1 AP2/ERF类转录因子概述
        2.2.2 AP2/ERF应用于基因工程育种
        2.2.3 AP2/ERF类转录因子代谢机理
    2.3 本研究主要内容和技术路线
        2.3.1 研究的主要内容
        2.3.2 研究的技术路线
第三章 百脉根种质资源评价
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 材料种植
        3.2.2 形态特征和农艺性状
        3.2.3 基因组DNA的提取
        3.2.4 ITS反应体系
        3.2.5 系统发育分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 百脉根形态的多样性
        3.3.2 农艺性状多样性
        3.3.3 基于ITS序列的系统发育
    3.4 讨论
第四章 百脉根新种质创制
    4.1 实验材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株与质粒
        4.1.3 药品和试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 百脉根遗传转化
        4.2.2 遗传转化植株的培养
        4.2.3 PCR检测
        4.2.4 RNA提取及cDNA合成方法
        4.2.5 半定量PCR
        4.2.6 盐及干旱胁迫处理
        4.2.7 生理生化指标的测定方法
        4.2.8 荧光定量PCR检测
        4.2.9 分析软件及数据库查询
    4.3 结果与分析
        4.3.1 共表达PeDREB2a和KcERF百脉根株系的获得
        4.3.2 共表达PeDREB2a和KcERF百脉根株系中目的基因表达量分析
        4.3.3 共表达PeDREB2a和KcERF百脉根无性繁殖苗的获得
        4.3.4 盐胁迫和干旱对共表达PeDREB2a和KcERF百脉根株系表型的影响
        4.3.5 干旱胁迫下共表达PeDREB2a和KcERF百脉根株系组织染色分析
        4.3.6 盐胁迫和干旱对百脉根转化株系相对含水量和膜透性的影响
        4.3.7 干旱胁迫对百脉根转化株系丙二醛和脯氨酸含量的影响
        4.3.8 盐胁迫和干旱对百脉根转化株系逆境相关基因表达的影响
    4.4 讨论
第五章 百脉根LcSRA13对植株表型和耐盐性的影响
    5.1 实验材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 菌株和载体
        5.1.3 药品和试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 LcSRA13基因生物信息学分析
        5.2.2 PCR产物的回收与纯化
        5.2.3 酶切反应
        5.2.4 连接反应
        5.2.5 大肠杆菌感受态的制备及转化
        5.2.6 农杆菌感受态的制备及转化
        5.2.7 百脉根遗传转化
        5.2.8 RNA提取及cDNA的合成
        5.2.9 半定量PCR
        5.2.10 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
        5.2.11 分析软件及数据库查询
        5.2.12 盐胁迫处理方法
        5.2.13 生理生化指标测定
    5.3 结果与分析
        5.3.1 LcSRA13基因序列分析
        5.3.2 LcSRA13过表达及干扰表达百脉根株系的获得
        5.3.3 LcSRA13过表达及干扰表达百脉根株系LcSRA13基因表达分析
        5.3.4 LcSRA13过表达及干扰表达对百脉根植株表型的影响
        5.3.5 LcSRA13过表达及干扰表达对百脉根耐盐表型的影响
        5.3.6 LcSRA13过表达及干扰表达百脉根耐盐组织化学染色分析
        5.3.7 LcSRA13过表达及干扰表达对百脉根耐盐生理生化指标的影响
    5.4 讨论
第六章 转录组分析LcSRA13参与的调控网络
    6.1 实验材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 药品和试剂
    6.2 实验方法
        6.2.1 转录组测序
        6.2.2 差异基因分析（NOISeq方法）
        6.2.3 基因功能和富集分析
        6.2.4 差异基因启动子分析
        6.2.5 荧光定量PCR分析
        6.2.6 酵母单杂交实验
        6.2.7 凝胶阻滞实验
        6.2.8 酵母双杂交试验
        6.2.9 双分子荧互补试验
    6.3 结果与分析
        6.3.1 差异表达基因
        6.3.2 差异表达基因聚类分析
        6.3.3 差异基因的GO（Gene Ontology）分析
        6.3.4 差异基因的Pathway显著性富集分析
        6.3.5 差异基因KEGG富集分析
        6.3.6 LcSRA13调控与生长及逆境胁迫相关基因
        6.3.7 LcSRA13基因直接调控的靶基因分析
        6.3.8 差异基因的荧光定量PCR验证
        6.3.9 LcSRA13结合Lj0g3v0242029启动子中的GCC-box
        6.3.10 Lj0g3v0242029编码的蛋白功能预测
        6.3.11 酵母双杂交验证百脉根LcSRA13和LcMED25蛋白互作
        6.3.12 BiFC验证百脉根LcSRA13和LcMED25互作
    6.4 讨论
第七章 全文结论与展望
    7.1 结论
    7.2 展望
    7.3 创新点
参考文献
附录
在学期间的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]百脉根对干旱胁迫的生长、生理生态响应及其抗旱性评价[J]. 陈超,赵丽丽,王普昶,任登鸿,戴全厚.  水土保持学报. 2014(03)
[2]秋茄ERF抗逆转录因子的克隆及其功能分析[J]. 刘博欣,赵杨敏,庞俊峰,孙占敏,尉亚辉,吴燕民.  草业科学. 2013(11)
[3]土壤盐渍化研究现状及未来研究热点[J]. 李建国,濮励杰,朱明,张润森.  地理学报. 2012(09)
[4]百脉根种子萌发期抗旱性综合评价[J]. 赵丽丽,陈超,王普昶.  贵州农业科学. 2012(09)
[5]百脉根种质苗期抗旱性鉴定及综合评价[J]. 赵海明,孙桂枝,王学敏,刘贵波.  草原与草坪. 2011(06)
[6]超表达AVP1基因提高转基因百脉根的耐盐性和抗旱性[J]. 程星,王燕雯,包爱科,王锁民.  植物生理学通讯. 2010(08)
[7]百脉根基因工程研究进展[J]. 程星,包爱科,冯波,王锁民.  生物技术通报. 2009(04)
[8]猪瘟病毒E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点整合载体的构建[J]. 杨宗岐,李轶女,张志芳,王勇,沈桂芳.  中国农业科学. 2007(11)
[9]百脉根早熟品系农艺性状初报[J]. 闫向忠,曹致中,冯玉兰,王敬龙.  甘肃农业大学学报. 2007(04)
[10]口蹄疫病毒P12A-3C免疫原基因在百脉根中的遗传转化与表达[J]. 王炜,张永光,潘丽,王永录,方玉珍,蒋守田,张维德,吕建亮,孙元,智晓莹,黄振华,刘力宽.  中国人兽共患病学报. 2007(03)

博士论文
[1]拟南芥TWD1调节油菜素甾醇信号转导通路的早期过程[D]. 赵宝林.兰州大学 2016
[2]BAK1在BR信号转导中的重要性及ARF7降解机制的研究[D]. 尹红菊.兰州大学 2015



本文编号：2897016