龙牙楤木β-AS基因与三七SS基因功能的初步研究
发布时间：2021-02-04 22:57
龙牙楤木和三七都是五加科重要药用植物,龙牙楤木中香树素合酶基因0β-AS)及三七鲨烯合酶基因（PnSS）都是三萜皂苷类物质合成过程中的关键酶基因。本文将龙牙楤木β-AS基因与三七PSS基因分别转入烟草与龙牙楤木中,利用qRT-PCR方法检测转基因烟草及龙牙楤木中4种关键酶基因（FPS、SS、SE、β-AS）和龙牙楤木中PnS基因的相对表达量,利用高效液相分析方法检测转基因龙牙楤木愈伤与体胚中角鲨烯和齐墩果酸的含量,并探究了 MeJA处理对转基因楤木体胚皂苷合成4种关键酶基因相对表达量与角鲨烯和齐墩果酸含量的影响。具体结果如下:1.构建龙牙楤木β-AS基因植物表达载体,获得12个转基因烟草株系,检测4种关键酶基因的相对表达量,结果显示转基因烟草4种酶基因的相对表达量显著高于野生型,其中株系16、17相对表达量显著高于其它株系;株系16的FPS、SS基因的相对表达量最高;株系17的SE、β-AS基因的相对表达量最高。2.将三七SS基因转入龙牙楤木中,得到6个转基因龙牙楤木胚性愈伤组织系与6个体胚苗系,检测了转基因株系中4种关键酶基因的相对表达量。转基因愈伤组织系中,下列无性系中关键酶基因的...
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１?（３－ＡＳ基因扩增结果??
??图２－２表达载体的ＰＣＲ鉴定??注：图中数字为挑取的单菌落??２．３．２龙牙锪木基因转化烟草及检测??２．３．２．１?ＰｒｏｋＩＩ－＾４５表达载体转化农杆菌??用Ｐｒｏｋｌｌ－＾－ｊＳ质粒转化农杆菌，２８°Ｃ恒温培养２天，随机挑取单克隆，以／ＶｏＨＺ－??Ｆ和尽？儿Ｓ－ｉ？为引物进行菌液ＰＣＲ，１％凝胶电泳结果显示，有单菌落扩增出大约２?２００??ｂｐ左右的扩增片段，与目标片段的大小相似，如图２－３所示，ＰｒｏｋＩＩ－界乂Ｓ质粒成功转??入农杆菌中，可以进行下一步的实验。??Ｍａｒｔｔａ？?＾?２３名?Ｓ?６?７?８??Ｓ３０００Ｐ?＾?＂＊?Ｘ?＾?ｒ％?＼?，??ｎ．。?．ｆ．＂１??２０００＆ｅ?ｋ：．＇??１５００ｂｐ——??ｉｏｏ〇ｂｐ?ｊ??７５Ｓ３〇??５０Ｑ〇ｐ?＿?：ｊ??２００ｂ〇???＾０％ｐ?Ｖ＇ｊ??图２－３农杆菌转化ＰＣＲ验证??注：图中数字为挑取的单菌落??２．３．２．２转基因烟草植物再生??剪切烟草叶子，放入培养基中预培养三天，利用农杆菌菌液侵染烟草叶片，共培养??２?ｄ后（如图２－４?Ａ），将其放在选择培养基中光培养，农杆菌的生长受到头孢霉素、特美??汀的抑制
??图２－４转基因烟草再生??注：Ａ：共培养烟草；Ｂ：转化培养２０天；Ｃ：非转基因烟草；Ｄ：转基因烟草??２．３．２．３转基因烟草检测??经过筛选，获得３０个烟草系。利用ＰＣＲ技术初步筛选了?１２个阳性愈伤组织系（株??系?７，１４，１５，１６，１７，?２０，２１，２２，２３，?２４，２６，２８）凝胶电泳结果如图?２－５?所示。??Ｍａｆｔｅｆ?１?ＩＳ?ｉ７?１８?２０?２１?２ｇ?Ｓ５?Ｓ?ＳＳ?２７?２３?ｇ？?２?３?木??＇．ＯＤＤｂｐ?；＇Ｖ＇?＾??Ｍａｒｋｅｒ?４?５?７?８?１０?１１?１２?１３?１４?１５?２９?幻?水??ＪＢＢＢｉ??图２－５再生植株ＰＣＲ检测??注：图中数字为不同株系烟草??２．３．３转基因烟草中关键酶基因表达分析??利用ｑＲＴ－ＰＣＲ的方法检测了野生型与转基因烟草仲又涊、见、斤必基因相对表??达量，结果如图２－６所示：转基因烟草即义怒、见、／？－必基因的相对表达量显著高于??野生型，其中株系１６、１７相对表达量显著高于其它株系及对照，株系１６的沖又怒基??因的相对表达量最高；株系１７的Ｓ￡、基因的相对表达量最高。??ｉｌＬｉＷｉ?幽丄二??ＷＴ?７?１６?１７?２Ｘ?２＊?２６??烟草株系?ＷＴ?７?１６?１７?ＺＬ?２４?２６??烟草株系??１〇〇?厂?ａ??６０「
【参考文献】：
期刊论文
[1]藜麦β-香树酯醇合酶和鲨烯合酶基因的克隆与表达[J]. 姜晓东,李新凤,郝艳平,赵靓,吕晋慧,贾举庆,张春来. 土壤. 2018(06)
[2]罗汉果角鲨烯环氧酶基因的克隆及表达分析[J]. 赵欢,郭娟,唐其,郭兰萍,黄璐琦,马小军. 中国中药杂志. 2018(16)
[3]雷公藤鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析[J]. 祝传书,刘艳,陈蒙蒙,蒲时,冯俊涛,张兴. 西北植物学报. 2018(05)
[4]洋常春藤β-AS基因的全长克隆与表达分析[J]. 孙化鹏,钟晓红,徐子健,乔飞. 分子植物育种. 2018(03)
[5]从龙牙楤木药材乙醇提取物中水解楤木皂苷工艺优选[J]. 姚丽琴,田明. 中国中医药信息杂志. 2018(01)
[6]南瓜DNA提取方法比较分析[J]. 陈学进,郭卫丽,姜立娜,李新峥,周俊国. 中国瓜菜. 2018(01)
[7]刺五加法尼基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶基因启动子CpG岛的预测与功能验证[J]. 龙月红,宋菊,林丽梅,尹峰,邢朝斌. 中草药. 2017(24)
[8]建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究[J]. 刘青芝,谷巍,吴启南,巢建国,桑晓华,刘琪,王小浩. 中国中药杂志. 2017(19)
[9]茉莉酸甲酯调控下人参发状根皂苷合成相关基因表达的研究[J]. 王康宇,于丽莉,张美萍,尹锐,林彦萍,赵明珠,孙春玉,王义. 中国中药杂志. 2017(12)
[10]滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究[J]. 许燕,赵爽,董栩,叶鑫. 中草药. 2017(09)
博士论文
[1]酿酒酵母中β-香树脂醇合成途径的构建与调控[D]. 张根林.北京理工大学 2015
[2]MeJA对人参DS基因表达的影响及DS在酵母中的表达[D]. 徐立新.吉林大学 2011
硕士论文
[1]灵芝细胞悬浮培养中高表达灵芝鲨烯合酶基因提高灵芝酸单体的生产[D]. 任梦飞.昆明理工大学 2015
[2]三七、西洋参中三萜皂苷合成关键酶基因的克隆及表达模式分析[D]. 牛云云.北京协和医学院 2013
[3]灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆及其表达特性的研究[D]. 姚健.南京农业大学 2011
[4]人参皂苷合成关键酶βAS基因转化水稻的研究[D]. 郭明殊.福建农林大学 2010
[5]龙牙楤木总皂甙对大鼠心肌缺血再灌注损伤sVCAM-1表达及MDA、SOD影响的研究[D]. 王婷.北京中医药大学 2009
本文编号：3019071
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１?（３－ＡＳ基因扩增结果??
??图２－２表达载体的ＰＣＲ鉴定??注：图中数字为挑取的单菌落??２．３．２龙牙锪木基因转化烟草及检测??２．３．２．１?ＰｒｏｋＩＩ－＾４５表达载体转化农杆菌??用Ｐｒｏｋｌｌ－＾－ｊＳ质粒转化农杆菌，２８°Ｃ恒温培养２天，随机挑取单克隆，以／ＶｏＨＺ－??Ｆ和尽？儿Ｓ－ｉ？为引物进行菌液ＰＣＲ，１％凝胶电泳结果显示，有单菌落扩增出大约２?２００??ｂｐ左右的扩增片段，与目标片段的大小相似，如图２－３所示，ＰｒｏｋＩＩ－界乂Ｓ质粒成功转??入农杆菌中，可以进行下一步的实验。??Ｍａｒｔｔａ？?＾?２３名?Ｓ?６?７?８??Ｓ３０００Ｐ?＾?＂＊?Ｘ?＾?ｒ％?＼?，??ｎ．。?．ｆ．＂１??２０００＆ｅ?ｋ：．＇??１５００ｂｐ——??ｉｏｏ〇ｂｐ?ｊ??７５Ｓ３〇??５０Ｑ〇ｐ?＿?：ｊ??２００ｂ〇???＾０％ｐ?Ｖ＇ｊ??图２－３农杆菌转化ＰＣＲ验证??注：图中数字为挑取的单菌落??２．３．２．２转基因烟草植物再生??剪切烟草叶子，放入培养基中预培养三天，利用农杆菌菌液侵染烟草叶片，共培养??２?ｄ后（如图２－４?Ａ），将其放在选择培养基中光培养，农杆菌的生长受到头孢霉素、特美??汀的抑制
??图２－４转基因烟草再生??注：Ａ：共培养烟草；Ｂ：转化培养２０天；Ｃ：非转基因烟草；Ｄ：转基因烟草??２．３．２．３转基因烟草检测??经过筛选，获得３０个烟草系。利用ＰＣＲ技术初步筛选了?１２个阳性愈伤组织系（株??系?７，１４，１５，１６，１７，?２０，２１，２２，２３，?２４，２６，２８）凝胶电泳结果如图?２－５?所示。??Ｍａｆｔｅｆ?１?ＩＳ?ｉ７?１８?２０?２１?２ｇ?Ｓ５?Ｓ?ＳＳ?２７?２３?ｇ？?２?３?木??＇．ＯＤＤｂｐ?；＇Ｖ＇?＾??Ｍａｒｋｅｒ?４?５?７?８?１０?１１?１２?１３?１４?１５?２９?幻?水??ＪＢＢＢｉ??图２－５再生植株ＰＣＲ检测??注：图中数字为不同株系烟草??２．３．３转基因烟草中关键酶基因表达分析??利用ｑＲＴ－ＰＣＲ的方法检测了野生型与转基因烟草仲又涊、见、斤必基因相对表??达量，结果如图２－６所示：转基因烟草即义怒、见、／？－必基因的相对表达量显著高于??野生型，其中株系１６、１７相对表达量显著高于其它株系及对照，株系１６的沖又怒基??因的相对表达量最高；株系１７的Ｓ￡、基因的相对表达量最高。??ｉｌＬｉＷｉ?幽丄二??ＷＴ?７?１６?１７?２Ｘ?２＊?２６??烟草株系?ＷＴ?７?１６?１７?ＺＬ?２４?２６??烟草株系??１〇〇?厂?ａ??６０「
【参考文献】：
期刊论文
[1]藜麦β-香树酯醇合酶和鲨烯合酶基因的克隆与表达[J]. 姜晓东,李新凤,郝艳平,赵靓,吕晋慧,贾举庆,张春来. 土壤. 2018(06)
[2]罗汉果角鲨烯环氧酶基因的克隆及表达分析[J]. 赵欢,郭娟,唐其,郭兰萍,黄璐琦,马小军. 中国中药杂志. 2018(16)
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[6]南瓜DNA提取方法比较分析[J]. 陈学进,郭卫丽,姜立娜,李新峥,周俊国. 中国瓜菜. 2018(01)
[7]刺五加法尼基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶基因启动子CpG岛的预测与功能验证[J]. 龙月红,宋菊,林丽梅,尹峰,邢朝斌. 中草药. 2017(24)
[8]建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究[J]. 刘青芝,谷巍,吴启南,巢建国,桑晓华,刘琪,王小浩. 中国中药杂志. 2017(19)
[9]茉莉酸甲酯调控下人参发状根皂苷合成相关基因表达的研究[J]. 王康宇,于丽莉,张美萍,尹锐,林彦萍,赵明珠,孙春玉,王义. 中国中药杂志. 2017(12)
[10]滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究[J]. 许燕,赵爽,董栩,叶鑫. 中草药. 2017(09)
博士论文
[1]酿酒酵母中β-香树脂醇合成途径的构建与调控[D]. 张根林.北京理工大学 2015
[2]MeJA对人参DS基因表达的影响及DS在酵母中的表达[D]. 徐立新.吉林大学 2011
硕士论文
[1]灵芝细胞悬浮培养中高表达灵芝鲨烯合酶基因提高灵芝酸单体的生产[D]. 任梦飞.昆明理工大学 2015
[2]三七、西洋参中三萜皂苷合成关键酶基因的克隆及表达模式分析[D]. 牛云云.北京协和医学院 2013
[3]灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆及其表达特性的研究[D]. 姚健.南京农业大学 2011
[4]人参皂苷合成关键酶βAS基因转化水稻的研究[D]. 郭明殊.福建农林大学 2010
[5]龙牙楤木总皂甙对大鼠心肌缺血再灌注损伤sVCAM-1表达及MDA、SOD影响的研究[D]. 王婷.北京中医药大学 2009
本文编号：3019071
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