玉米单倍体诱导关键基因定位与克隆及新型高油诱导系选育研究
发布时间：2021-03-25 07:16
基于Stock6来源诱导系的玉米单倍体育种技术在当前已经成为快速选育玉米自交系的重要手段,而玉米诱导产生单倍体的遗传学基础及生物学机理仍不清楚。本研究主要围绕玉米单倍体诱导相关QTL精细定位、诱导基因克隆与功能验证、高油型玉米单倍体诱导系选育及玉米单倍体诱导过程中的异雄核籽粒发生机制进行探究。本研究的主要结论如下:1)在控制诱导率的主效QTL精细定位研究的基础上,构建了诱导系材料CAU5的BAC文库,通过阳性克隆筛选及测序分析,获得了该区段的BAC序列。并根据序列比对与功能注释,在该区段内13个基因中确定了编码磷脂酶（ZmPL41）的基因为候选基因。通过CRISPR/Cas9定点突变技术将野生型玉米材料的ZmPLA1基因突变后,使其获得了单倍体诱导能力,说明该基因的突变就是导致Stock6来源诱导系诱导玉米单倍体产生的原因。2)通过测序发现,诱导系中基因Zmpla1与B73的ZmPLA1序列在外显子上共存在11个单碱基替换突变和1个4bp插入突变。本研究利用50个不同来源自交系的ZmPLA1基因测序分析结果证明,4bp插入是导致玉米单倍体诱导功能产生的原因。RNA-seq数据表明,相比...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：88 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２－３磷脂酶编码基因ＧＲＭＺＭ２?
编码乙酰??转移酶基因ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８的第一外显子处设计靶位点，构建了?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９载体。对构建??成功的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９载体进行突变效率检测，将ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９载体转化到玉米叶片原生质体中，??提取原生质体ＤＮＡ，将目的片段扩增出来进行酶切鉴定，结果表明，在未转化的原生质体中，??其ＰＣＲ产物均能够被内切酶ＴＶｃｏ／切开，说明该酶切序列没有发生变异，而在转化??ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的处理中，ＰＣＲ产物大部分均不能被内切酶＆ｗ９＜５／／Ａ／ｃｏ／切幵（图２－４），因此说明，??在酶切位点发生了序列变异，导致变异后的序列不能被识别。为进一步证明靶位点的序列发生了、??变异，对ＰＣＲ产物纯化后连入Ｔ１载体，转化大肠杆菌后进行单克隆测序，测序结果表明，相对??于正常的序列，部分ＰＣＲ产物确实发生了序列的变异（图２－５），其中有的发生了?１个ｂｐ的缺失，??有的发生了?４个ｂｐ的缺失。从而证明了该ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的突变能力。??ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７１２４０??２?－?＋??—??图２－４转化后原生质体基因突变效率检测??Ｆｉｇｕｒｅ?２－４?Ｍｕｔａｎｔｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９??１８??
户国农业大学博士学位论文?第二章劝／＞／候选基因的克隆与功能验证??ＣＳ２－１９?双峰?缺失?１?（Ｃ）或插入?１（Ａ）或缺失?１３ｂｐ?ＴＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡ??ＣＳ２－２８?双峰?插入?１?（Ｃ）或缺失?ｌｌｂｐ?ＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣ??ＣＳ２－３１?双峰?缺失２６ｂｐ???ＣＳ３－１７?双峰?４ｂｐ缺失???２．２．５转基因材料的表型鉴定??１?？?突变后能够显著提高胚乳败育籽粒频率??Ｉ?Ｉ?ｉｆ?§?Ｉ??［?ｋｍ?Ｊｍ?Ａ??图２－６转基因果穗与对照（Ａ图为野生型受体材料自交的果穗，Ｂ图为ＺｍＰＬＺ／突变后自交的果穗。）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－６?ｅａｒｓ?ｐｅｒｆｏｎｎａｎｃｅ?ｏｆ?ＺｍＰＬＡｌ?Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ?ｌｉｎｅ?ａｎｄ?ｗｉｌｄｔｙｐｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?（ｌｅｆｔ：?ｅａｒｓ?ｏｆ?ｗｉｌｄｔｙｐｅ，?ｒｉｇｈｔ：?ｅａｒｓ?ｏｆ??ＺｍＰＬＡｌ?ＩＣｎｏｃｋ－ｏｕｔ?ｌｉｎｅ）??在２０１６年５月获得的Ｚｍｐ／ｄ转基因果穗中发现了少量的胚乳败育的情况，但是由于果穗的??数量较少，且温室内获得的果穗上本身也有一定频率的败育籽粒，因此不能确定是由于温室环境??引起的还是基因突变造成的。但是在基因ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８的突变体材料中发现败育较少。推??测可能是导致单倍体产生的候选基因。为进一步验证，２０１６年６月在通州种植了?Ｔ，代转??基因材料，为保证有充分的测验量，每个转基因家系种植至少１０棵。在自交的果穗中发现，??基因突变后，在果穗上有显著多的胚乳败育籽粒（图２－６Ｂ）。而在对照材料和ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８??的突变体中，并没有发现胚乳败育籽粒频率提高（图
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同播期对玉米单倍体自然加倍效果的影响[J]. 王文洁,周联东,刘经纬,孙佩,王蕊. 河南农业科学. 2015(01)
[2]作物育种工程化与工程化育种思考[J]. 陈绍江. 作物杂志. 2013(06)
[3]玉米单倍体在黑龙江与海南自然加倍效果的对比研究[J]. 蔡泉,曹靖生,史桂荣,郭晓明,张建国,赵伟,李树军,殷跃. 玉米科学. 2012(05)
[4]玉米单倍体核磁共振自动分拣系统的开发(英文)[J]. 刘金,郭婷婷,杨培强,汪红志,刘利荣,陆治勇,徐小萍,胡靖丽,黄清明,陈绍江. 农业工程学报. 2012(S2)
[5]玉米单倍体在春夏不同播期条件下的自然加倍效果研究[J]. 芦连勇,王海莉,董文恒,宋俊乔. 安徽农业科学. 2012(18)
[6]玉米单倍体育种研究进展[J]. 杜何为,戴景瑞,李建生. 玉米科学. 2010(06)
[7]花药离体培养研究进展[J]. 王茂良,冯慧. 北京农学院学报. 2010(03)
[8]玉米自交系选育的理论基础与实践经验[J]. 张铭堂,徐国良,才卓. 玉米科学. 2010(02)
[9]玉米单倍体育种研究进展[J]. 才卓,徐国良,张铭堂,路明. 玉米科学. 2008(01)
[10]利用高油分的花粉直感效应鉴别玉米单倍体[J]. 陈绍江,宋同明. 作物学报. 2003(04)
博士论文
[1]玉米单倍体诱导效应分析与机器学习在DH技术中的应用[D]. 李伟.中国农业大学 2017
[2]玉米单倍体诱导基因qhir1精细定位与新型诱导系选育研究[D]. 董昕.中国农业大学 2014
[3]玉米生物诱导单倍体雄穗育性恢复研究[D]. 吴鹏昊.中国农业大学 2014
本文编号：3099282
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：88 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２－３磷脂酶编码基因ＧＲＭＺＭ２?
编码乙酰??转移酶基因ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８的第一外显子处设计靶位点，构建了?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９载体。对构建??成功的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９载体进行突变效率检测，将ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９载体转化到玉米叶片原生质体中，??提取原生质体ＤＮＡ，将目的片段扩增出来进行酶切鉴定，结果表明，在未转化的原生质体中，??其ＰＣＲ产物均能够被内切酶ＴＶｃｏ／切开，说明该酶切序列没有发生变异，而在转化??ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的处理中，ＰＣＲ产物大部分均不能被内切酶＆ｗ９＜５／／Ａ／ｃｏ／切幵（图２－４），因此说明，??在酶切位点发生了序列变异，导致变异后的序列不能被识别。为进一步证明靶位点的序列发生了、??变异，对ＰＣＲ产物纯化后连入Ｔ１载体，转化大肠杆菌后进行单克隆测序，测序结果表明，相对??于正常的序列，部分ＰＣＲ产物确实发生了序列的变异（图２－５），其中有的发生了?１个ｂｐ的缺失，??有的发生了?４个ｂｐ的缺失。从而证明了该ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的突变能力。??ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７１２４０??２?－?＋??—??图２－４转化后原生质体基因突变效率检测??Ｆｉｇｕｒｅ?２－４?Ｍｕｔａｎｔｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９??１８??
户国农业大学博士学位论文?第二章劝／＞／候选基因的克隆与功能验证??ＣＳ２－１９?双峰?缺失?１?（Ｃ）或插入?１（Ａ）或缺失?１３ｂｐ?ＴＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡ??ＣＳ２－２８?双峰?插入?１?（Ｃ）或缺失?ｌｌｂｐ?ＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣ??ＣＳ２－３１?双峰?缺失２６ｂｐ???ＣＳ３－１７?双峰?４ｂｐ缺失???２．２．５转基因材料的表型鉴定??１?？?突变后能够显著提高胚乳败育籽粒频率??Ｉ?Ｉ?ｉｆ?§?Ｉ??［?ｋｍ?Ｊｍ?Ａ??图２－６转基因果穗与对照（Ａ图为野生型受体材料自交的果穗，Ｂ图为ＺｍＰＬＺ／突变后自交的果穗。）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－６?ｅａｒｓ?ｐｅｒｆｏｎｎａｎｃｅ?ｏｆ?ＺｍＰＬＡｌ?Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ?ｌｉｎｅ?ａｎｄ?ｗｉｌｄｔｙｐｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?（ｌｅｆｔ：?ｅａｒｓ?ｏｆ?ｗｉｌｄｔｙｐｅ，?ｒｉｇｈｔ：?ｅａｒｓ?ｏｆ??ＺｍＰＬＡｌ?ＩＣｎｏｃｋ－ｏｕｔ?ｌｉｎｅ）??在２０１６年５月获得的Ｚｍｐ／ｄ转基因果穗中发现了少量的胚乳败育的情况，但是由于果穗的??数量较少，且温室内获得的果穗上本身也有一定频率的败育籽粒，因此不能确定是由于温室环境??引起的还是基因突变造成的。但是在基因ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８的突变体材料中发现败育较少。推??测可能是导致单倍体产生的候选基因。为进一步验证，２０１６年６月在通州种植了?Ｔ，代转??基因材料，为保证有充分的测验量，每个转基因家系种植至少１０棵。在自交的果穗中发现，??基因突变后，在果穗上有显著多的胚乳败育籽粒（图２－６Ｂ）。而在对照材料和ＧＲＭＺＭ５Ｇ８６６７５８??的突变体中，并没有发现胚乳败育籽粒频率提高（图
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同播期对玉米单倍体自然加倍效果的影响[J]. 王文洁,周联东,刘经纬,孙佩,王蕊. 河南农业科学. 2015(01)
[2]作物育种工程化与工程化育种思考[J]. 陈绍江. 作物杂志. 2013(06)
[3]玉米单倍体在黑龙江与海南自然加倍效果的对比研究[J]. 蔡泉,曹靖生,史桂荣,郭晓明,张建国,赵伟,李树军,殷跃. 玉米科学. 2012(05)
[4]玉米单倍体核磁共振自动分拣系统的开发(英文)[J]. 刘金,郭婷婷,杨培强,汪红志,刘利荣,陆治勇,徐小萍,胡靖丽,黄清明,陈绍江. 农业工程学报. 2012(S2)
[5]玉米单倍体在春夏不同播期条件下的自然加倍效果研究[J]. 芦连勇,王海莉,董文恒,宋俊乔. 安徽农业科学. 2012(18)
[6]玉米单倍体育种研究进展[J]. 杜何为,戴景瑞,李建生. 玉米科学. 2010(06)
[7]花药离体培养研究进展[J]. 王茂良,冯慧. 北京农学院学报. 2010(03)
[8]玉米自交系选育的理论基础与实践经验[J]. 张铭堂,徐国良,才卓. 玉米科学. 2010(02)
[9]玉米单倍体育种研究进展[J]. 才卓,徐国良,张铭堂,路明. 玉米科学. 2008(01)
[10]利用高油分的花粉直感效应鉴别玉米单倍体[J]. 陈绍江,宋同明. 作物学报. 2003(04)
博士论文
[1]玉米单倍体诱导效应分析与机器学习在DH技术中的应用[D]. 李伟.中国农业大学 2017
[2]玉米单倍体诱导基因qhir1精细定位与新型诱导系选育研究[D]. 董昕.中国农业大学 2014
[3]玉米生物诱导单倍体雄穗育性恢复研究[D]. 吴鹏昊.中国农业大学 2014
本文编号：3099282
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/3099282.html
最近更新
教材专著
