农杆菌介导海岛棉Bt基因的遗传转化及鉴定
发布时间：2021-03-31 12:26
本研究是在海岛棉再生体系的基础上以新疆海岛棉33号棉种为材料,获得胚性愈伤后对其进行Bt基因的遗传转化研究。对获得的转基因植株进行分子检测以及室内生物测定,初步确定Bt基因已整合到海岛棉品种的基因组中,并对棉铃虫具有一定的抗性作用,结果如下:切取无菌苗下胚轴为外植体,采用0.1 mg·L-11 2,4-D和0.1 mg·L-11 KT激素组合诱导愈伤组织,20 d继代培养1次,至分化获得胚性愈伤组织。将携带Bt-Cry1A基因的表达载体pBI121通过农杆菌介导法转化到新疆海岛棉33号的胚性愈伤组织中。经含有Kan(50 mg·L-1)和Cef(500 mg·L-1)的培养基筛选后得到抗性胚性愈伤组织,在KNO3加倍、NH4NO3减为1/4的分化培养基中分化出体细胞胚,大量减为1/2的培养基中获得抗性苗,对获得的抗性苗采用嫁接的方法以提高成活率,共获得12棵抗性植株。对嫁接得到的12棵抗性植株进行分子检测,结果如下:PCR检测结果显示...
【文章来源】：新疆农业大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PBI121/Bt-Cry1A表达载体示意图
新疆农业大学硕士学的长面相同，待用。将转基因苗在超净工作台内切取上段，将切下来的转基削一长斜面，长面的对侧削一短面，留一至二片叶片，去除多余的叶片作接穗插入待用的砧木切口内，使长削面与砧木的中柱对齐，短削面紧贴砧使皮层包裹在接穗外面，然后用绳子将其砧木和接穗接触处绑紧。浇水充分色透明塑料薄膜或者塑料袋将完成嫁接的植株罩住，以防止水分散失。遮阴 d 后逐渐开始通气，7-10 d后，去掉塑料薄膜或者塑料袋。
A：抗性苗；B：待嫁接的抗性植株；C：白色透明塑料薄膜罩住；D：嫁接成活的抗性植株A：Resistant seedlings；B：The grafted plants to be grafted；C：White transparent plastic film cover；D：Grafted survived resistant plants图 3-2 抗性植株的嫁接Fig. 3-2 Grafting of resistant plants3.2 转基因植株的 PCR 检测采用改良 CTAB 法提取 12 抗性植株的基因组 DNA，并分别利用 Bt 基因特异性引物、GUS 基因特异性引物和 35S Promoter 特异性引物对抗性植株进行 PCR 鉴定。结果如图，Bt-F 和 Bt-R 引物可扩增出 400 bp 的目的片段（图 3-3-A），GUS-F 和 GUS-R 可扩增出 396 bp 的目的片段（图 3-3-B），P-F 和 P-R 扩增到 277 bp 的目的片段（图 3-3C），三对引物均扩增出与预期片段大小相符的产物，其中阳性对照质粒扩增出了大小相符的片段，而在阴性对照及非转基因对照中没有目的片段的扩增条带，初步鉴定得到的 12棵抗性植株均为转基因阳性植株。
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同激素和外植体对柱花草愈伤组织诱导及体细胞胚的影响[J]. 靳慧卿,米福贵,闫利军,云雅聪,冀晓婷,富海江. 中国草地学报. 2016(06)
[2]甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 卢会翔,吕长文,吴正丹,罗凯,尹旺,杨航,王季春,张凯. 中国农业科学. 2016(01)
[3]转Cry1Ac-w基因抗虫玉米的获得及分子鉴定[J]. 燕树锋,铁双贵,岳润清,韩小花,齐建双,卢彩霞. 华北农学报. 2015(05)
[4]中国转基因棉花研发应用二十年[J]. 郭三堆,王远,孙国清,金石桥,周焘,孟志刚,张锐. 中国农业科学. 2015(17)
[5]新疆海岛棉转基因育种的研究进展[J]. 苏豫梅. 南方农业. 2015(24)
[6]转基因棉花研究与应用进展[J]. 李常凤,郑曙峰. 安徽农学通报. 2015(Z1)
[7]海岛棉和陆地棉叶片光合特性、冠层结构及物质生产的差异[J]. 姚贺盛,张亚黎,易小平,薛军,罗毅,罗宏海,张旺锋. 中国农业科学. 2015(02)
[8]农杆菌介导棉花遗传转化影响因素的研究[J]. 刘卫民,李琼. 农业科技通讯. 2014(12)
[9]Northern杂交检测家蚕microRNA的技术流程[J]. 刘仕平,夏庆友. 蚕业科学. 2014(04)
[10]PCR技术的研究及应用[J]. 张许文琦. 长江工程职业技术学院学报. 2013(03)
博士论文
[1]新型转基因抗草甘膦玉米的培育及转基因玉米安全控制技术的研究[D]. 李京.浙江大学 2013
硕士论文
[1]转g10evo基因抗草甘膦大豆的研究[D]. 谭苗苗.浙江大学 2016
[2]农杆菌介导的海岛棉转Bt基因遗传转化研究[D]. 丁喜莲.新疆农业大学 2015
[3]甘蓝型油菜抗草甘膦基因遗传转化及其抗性鉴定[D]. 徐茜.浙江大学 2014
[4]棉花体细胞胚胎发生机制研究及p53基因的遗传转化[D]. 李琼.新疆农业大学 2012
[5]农杆菌介导转Bt基因海岛棉技术体系的建立及抗虫性鉴定[D]. 周丽容.新疆农业大学 2011
[6]海岛棉再生体系的建立及SATI基因遗传转化初步研究[D]. 贺雅婷.新疆农业大学 2008
[7]海岛棉（G.barbadense L.）茎尖再生体系的建立及农杆菌介导抗虫基因（Bt；SATI）转化研究[D]. 翁琴.新疆农业大学 2007
[8]农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系的建立及转AFP-SPCEMA基因棉花的获得[D]. 鲁秀敏.西南农业大学 2003
本文编号：3111436
【文章来源】：新疆农业大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PBI121/Bt-Cry1A表达载体示意图
新疆农业大学硕士学的长面相同，待用。将转基因苗在超净工作台内切取上段，将切下来的转基削一长斜面，长面的对侧削一短面，留一至二片叶片，去除多余的叶片作接穗插入待用的砧木切口内，使长削面与砧木的中柱对齐，短削面紧贴砧使皮层包裹在接穗外面，然后用绳子将其砧木和接穗接触处绑紧。浇水充分色透明塑料薄膜或者塑料袋将完成嫁接的植株罩住，以防止水分散失。遮阴 d 后逐渐开始通气，7-10 d后，去掉塑料薄膜或者塑料袋。
A：抗性苗；B：待嫁接的抗性植株；C：白色透明塑料薄膜罩住；D：嫁接成活的抗性植株A：Resistant seedlings；B：The grafted plants to be grafted；C：White transparent plastic film cover；D：Grafted survived resistant plants图 3-2 抗性植株的嫁接Fig. 3-2 Grafting of resistant plants3.2 转基因植株的 PCR 检测采用改良 CTAB 法提取 12 抗性植株的基因组 DNA，并分别利用 Bt 基因特异性引物、GUS 基因特异性引物和 35S Promoter 特异性引物对抗性植株进行 PCR 鉴定。结果如图，Bt-F 和 Bt-R 引物可扩增出 400 bp 的目的片段（图 3-3-A），GUS-F 和 GUS-R 可扩增出 396 bp 的目的片段（图 3-3-B），P-F 和 P-R 扩增到 277 bp 的目的片段（图 3-3C），三对引物均扩增出与预期片段大小相符的产物，其中阳性对照质粒扩增出了大小相符的片段，而在阴性对照及非转基因对照中没有目的片段的扩增条带，初步鉴定得到的 12棵抗性植株均为转基因阳性植株。
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同激素和外植体对柱花草愈伤组织诱导及体细胞胚的影响[J]. 靳慧卿,米福贵,闫利军,云雅聪,冀晓婷,富海江. 中国草地学报. 2016(06)
[2]甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 卢会翔,吕长文,吴正丹,罗凯,尹旺,杨航,王季春,张凯. 中国农业科学. 2016(01)
[3]转Cry1Ac-w基因抗虫玉米的获得及分子鉴定[J]. 燕树锋,铁双贵,岳润清,韩小花,齐建双,卢彩霞. 华北农学报. 2015(05)
[4]中国转基因棉花研发应用二十年[J]. 郭三堆,王远,孙国清,金石桥,周焘,孟志刚,张锐. 中国农业科学. 2015(17)
[5]新疆海岛棉转基因育种的研究进展[J]. 苏豫梅. 南方农业. 2015(24)
[6]转基因棉花研究与应用进展[J]. 李常凤,郑曙峰. 安徽农学通报. 2015(Z1)
[7]海岛棉和陆地棉叶片光合特性、冠层结构及物质生产的差异[J]. 姚贺盛,张亚黎,易小平,薛军,罗毅,罗宏海,张旺锋. 中国农业科学. 2015(02)
[8]农杆菌介导棉花遗传转化影响因素的研究[J]. 刘卫民,李琼. 农业科技通讯. 2014(12)
[9]Northern杂交检测家蚕microRNA的技术流程[J]. 刘仕平,夏庆友. 蚕业科学. 2014(04)
[10]PCR技术的研究及应用[J]. 张许文琦. 长江工程职业技术学院学报. 2013(03)
博士论文
[1]新型转基因抗草甘膦玉米的培育及转基因玉米安全控制技术的研究[D]. 李京.浙江大学 2013
硕士论文
[1]转g10evo基因抗草甘膦大豆的研究[D]. 谭苗苗.浙江大学 2016
[2]农杆菌介导的海岛棉转Bt基因遗传转化研究[D]. 丁喜莲.新疆农业大学 2015
[3]甘蓝型油菜抗草甘膦基因遗传转化及其抗性鉴定[D]. 徐茜.浙江大学 2014
[4]棉花体细胞胚胎发生机制研究及p53基因的遗传转化[D]. 李琼.新疆农业大学 2012
[5]农杆菌介导转Bt基因海岛棉技术体系的建立及抗虫性鉴定[D]. 周丽容.新疆农业大学 2011
[6]海岛棉再生体系的建立及SATI基因遗传转化初步研究[D]. 贺雅婷.新疆农业大学 2008
[7]海岛棉（G.barbadense L.）茎尖再生体系的建立及农杆菌介导抗虫基因（Bt；SATI）转化研究[D]. 翁琴.新疆农业大学 2007
[8]农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系的建立及转AFP-SPCEMA基因棉花的获得[D]. 鲁秀敏.西南农业大学 2003
本文编号：3111436
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