microRNA调控玉米气生根发育的遗传机制研究
发布时间：2021-04-12 22:49
气生根是影响玉米抗倒伏能力的一个重要性状,在一定程度上决定着玉米的种植密度,与单位面积产量直接相关。玉米气生根形成不但受关键基因决定,而且受microRNA复杂的基因表达调控。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的长度约为20-25个核苷酸的非编码RNA。它们作用于靶基因mRNA的碱基互补区域,通过剪切降解靶mRNA或抑制靶mRNA转录后翻译实现对基因表达的调控。本研究利用Solexa高通量测序技术对玉米自交系昌7-2（气生根稀少）和12246（气生根发达）进行了microRNA分析,筛选在两个自交系间气生根发育相关的miRNA及其靶基因,并利用实时荧光定量PCR对差异的miRNA及其靶基因进行了验证。主要研究结果如下:1.Solexa高通量测序在两个自交系气生根中分别得到2,549,593和4,186,404个clean读数,通过分析共发现属于27个miRNA家族的202个保守microRNA。2.通过对气生根发育保守microRNA分析,得到与气生根发育相关的8个miRNA家族的32个保守microRNAs。利用荧光定量PCR的方法对zma...
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
植物miRNA生物发生过程[68]
11图3Poly(A)聚合酶加尾原理图[107]Figure3TheprinciplediagramofPoly(A)polymerasetail（1）miRNA加尾RT-PCRmiRNA加尾RT-PCR的原理为：首先poly(A)聚合酶（PAP）改变MaturemiRNA（图3），使MaturemiRNA的3’端位置加上一段大约4-6个碱基的poly(A)尾巴，然后用5’端含有poly(T)adapter的接头序列引物进行反转录（Reversetranscription），使第一链cDNA加上一段序列，为随后的PCR扩增（PCRamplification）提供反向通用引物序列(Reverseprimer)，再利用一条与miRNA序列特异的正向引物(miRNA-specificforwordprimer)就可实现PCR扩增(PCRproduct)。（2）茎环引物RT-PCR茎环引物RT-PCR的原理为：首先设计一条待测miRNA3’端的6-8个互补碱基并且能形成茎环结构的特异性引物对miRNA进行反转录反应，然后用反转录的产物作为反应模板进行qPCR扩增（图4）。Chen等利用茎环引物RT-PCR的方法比较了5种miRNA在小鼠组织中的差异表达[108]。Lee等也利用该方法进行了人体内细胞、组织和肿瘤中的多种miRNA在不同处理模式下的比较，得到了225种成熟和前体miRNA之间的表达相关性[109]。Feng等在利用茎环特异性引物对番茄中的7个miRNA进行反转录以及相对定量检测[110]。
12图4茎环引物RT-PCR原理图[121]Figure4Theprinciplediagramofthestem-loopprimerRT-PCR1.3.2.2Northern印迹杂交Northern印迹杂交[112]（Northernblot）是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。microRNAs常用LNA探针来完成Northern杂交以提高反应过程中的亲合性和检测灵敏度[113]。该方法的基本步骤是：（1）完整mRNA的分离（可以分离长度200nt以下的小RNA）。（2）将RNA转移到固相支持物上，要注意在转移的过程中保持RNA在凝胶中的相对分布。（3）固相RNA与标记的寡核苷酸探针杂交。（4）除去非特异结合到固相支持物上的探针分子，对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。1.4本研究的目的与意义尽管前人关于miRNA调控植物根系生长发育进行了大量研究[114,115,116]，而其参与气生根发育调控的研究报道则相对较少。气生根对玉米植株具有重要的固定与支撑作用，是决定玉米抗倒伏能力的一个重要性状，特别是随着玉米播种密度逐渐增大，植株的根系系统已经成为玉米抗倒伏能力的决定性性状之一。尽管前人曾经对玉米根系进行了大量研究，多数集中在根系的构型[117,118]、根系的数量[119]等方面，而对气生根的遗传机制报道较少。为研究miRNA对玉米气生根发育的可能调控机制，本研究选用了两个玉米自交系昌7-2和12246作为研究材料，其中昌7-2是我国玉米生产上的骨干自交系，来自唐四平头杂种优势类群，该材料气生根极少或者没有气生根；另一个自交系12246由本课题组利用昌7-2与美国杂交种选系选育的二环系，该材料具有气生根发达的特点，田间一般有3-4层气生根。本研究通过对两个自交系的第一节间气生根分生组织的miRNA进行高通量测序，研
本文编号：3134117
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
植物miRNA生物发生过程[68]
11图3Poly(A)聚合酶加尾原理图[107]Figure3TheprinciplediagramofPoly(A)polymerasetail（1）miRNA加尾RT-PCRmiRNA加尾RT-PCR的原理为：首先poly(A)聚合酶（PAP）改变MaturemiRNA（图3），使MaturemiRNA的3’端位置加上一段大约4-6个碱基的poly(A)尾巴，然后用5’端含有poly(T)adapter的接头序列引物进行反转录（Reversetranscription），使第一链cDNA加上一段序列，为随后的PCR扩增（PCRamplification）提供反向通用引物序列(Reverseprimer)，再利用一条与miRNA序列特异的正向引物(miRNA-specificforwordprimer)就可实现PCR扩增(PCRproduct)。（2）茎环引物RT-PCR茎环引物RT-PCR的原理为：首先设计一条待测miRNA3’端的6-8个互补碱基并且能形成茎环结构的特异性引物对miRNA进行反转录反应，然后用反转录的产物作为反应模板进行qPCR扩增（图4）。Chen等利用茎环引物RT-PCR的方法比较了5种miRNA在小鼠组织中的差异表达[108]。Lee等也利用该方法进行了人体内细胞、组织和肿瘤中的多种miRNA在不同处理模式下的比较，得到了225种成熟和前体miRNA之间的表达相关性[109]。Feng等在利用茎环特异性引物对番茄中的7个miRNA进行反转录以及相对定量检测[110]。
12图4茎环引物RT-PCR原理图[121]Figure4Theprinciplediagramofthestem-loopprimerRT-PCR1.3.2.2Northern印迹杂交Northern印迹杂交[112]（Northernblot）是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。microRNAs常用LNA探针来完成Northern杂交以提高反应过程中的亲合性和检测灵敏度[113]。该方法的基本步骤是：（1）完整mRNA的分离（可以分离长度200nt以下的小RNA）。（2）将RNA转移到固相支持物上，要注意在转移的过程中保持RNA在凝胶中的相对分布。（3）固相RNA与标记的寡核苷酸探针杂交。（4）除去非特异结合到固相支持物上的探针分子，对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。1.4本研究的目的与意义尽管前人关于miRNA调控植物根系生长发育进行了大量研究[114,115,116]，而其参与气生根发育调控的研究报道则相对较少。气生根对玉米植株具有重要的固定与支撑作用，是决定玉米抗倒伏能力的一个重要性状，特别是随着玉米播种密度逐渐增大，植株的根系系统已经成为玉米抗倒伏能力的决定性性状之一。尽管前人曾经对玉米根系进行了大量研究，多数集中在根系的构型[117,118]、根系的数量[119]等方面，而对气生根的遗传机制报道较少。为研究miRNA对玉米气生根发育的可能调控机制，本研究选用了两个玉米自交系昌7-2和12246作为研究材料，其中昌7-2是我国玉米生产上的骨干自交系，来自唐四平头杂种优势类群，该材料气生根极少或者没有气生根；另一个自交系12246由本课题组利用昌7-2与美国杂交种选系选育的二环系，该材料具有气生根发达的特点，田间一般有3-4层气生根。本研究通过对两个自交系的第一节间气生根分生组织的miRNA进行高通量测序，研
本文编号：3134117
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