百脉根共生受体激酶SymRK调控共生固氮的分子机制研究
发布时间：2021-04-21 17:15
豆科植物（legume）能够与根瘤菌（rhizobia）产生特异性的相互作用,进而在根部形成高度特化的器官--根瘤（nodule）,这个过程也被称作根瘤共生（Root Nodule Symbiosis,RNS）。在根瘤中,宿主植物为根瘤菌提供碳源以及稳定的生存环境,根瘤菌则通过固氮酶的固氮作用将大气中游离的氮气（N2）还原成氨（ammonia）以促进植物生长,二者互利互惠和谐共存。近20年以来的研究主要以模式豆科植物百脉根（Lotus japonicus）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）为材料,通过正向遗传学和反向遗传学等方法鉴定到了约200个参与RNS的基因,极大的丰富了我们对共生信号转导机制的认识。其中共生受体激酶Sym RK是根瘤菌与豆科植物之间早期信号识别的一个关键基因,但是其调控机制尚不完善。本研究以百脉根为材料,利用蛋白相互作用、CRISPR基因敲除、植物遗传转化等技术探讨了Sym RK及其互作蛋白在根瘤共生早期的功能,主要结果如下:1. 利用百脉根根瘤菌MAFF303099、人工合成的细菌鞭毛蛋白N端22个保守氨基酸（flg22）...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：161 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 研究综述
1.1 共生固氮研究概述
1.1.1 共生固氮的概念与意义
1.1.2 根瘤共生固氮
1.1.3 根瘤的形成过程
1.1.4 豆科植物与根瘤菌间早期信号分子的识别
1.2 植物免疫研究进展
1.2.1 植物的免疫反应
1.2.2 PTI
1.2.3 ETI
1.2.4 PTI与 ETI的协同作用
1.3 LRR类受体蛋白激酶
1.3.1 共生受体激酶SymRK
1.3.2共受体BAK1
1.4 蛋白的泛素化修饰
第二章 豆科共生受体激酶SymRK调控植物免疫防御反应的分子机制
1 前言
1.1 根瘤菌规避植物的PTI
1.2 根瘤菌对植物免疫的调节
1.3 植物自生对免疫的调节
1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 植物材料
2.2 载体和菌株
2.3 百脉根毛根转化
2.3.1 种子的萌发
2.3.2 农杆菌侵染与共培养
2.3.3 毛根鉴定（GUS染色）
2.3.4 毛根鉴定（荧光鉴定）
2.4 百脉根稳定转化
2.4.1 注意事项
2.4.2 相关试剂
2.4.3 种子的萌发
2.4.4 农杆菌侵染与共培养
2.4.5 愈伤筛选
2.4.6 芽诱导
2.4.7 茎诱导茎伸长
2.4.8 根诱导
2.4.9 稳定转化种子的筛选（潮霉素）
2.5 拟南芥花序侵染转化
2.5.1 拟南芥植株的准备
2.5.2 转化菌株的准备
2.5.3 潮霉素筛选种子
2.6 幼苗处理
2.6.1 百脉根幼苗处理
2.6.2 拟南芥幼苗处理
2.6.3 植物蛋白抽提
2.7 植物基因组抽提
2.8 百脉根LORE1突变体鉴定
2.9 表达分析
2.9.1 总RNA的制备
2.9.2 Real-Time PCR
2.10 Gibson等温一步法
2.10.1 Gibson反应液的配置
2.10.2 Gibson法克隆步骤
2.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
2.11.1 主要试剂的配置
2.11.2 主要操作步骤
2.12 WB实验步骤
2.13 原核蛋白表达与纯化
2.13.1 小规模诱导
2.13.2 大规模诱导
2.13.3 蛋白纯化
2.13.4 蛋白超滤
2.14 ROS测定
2.15 磷酸化
2.15.1 SDS–PAGE胶的选择
2.15.2 磷酸化
2.15.3 电泳
2.15.4 压屏
2.15.5 扫屏
2.15.6 注意事项
2.16 酵母双杂交系统
2.16.1 酵母培养基
2.16.2 酵母双杂交相关试剂
2.16.3 醋酸锂（LiAC）高效转化酵母方法
2.16.4 酵母的小范围Mating
2.17 免疫共沉淀
3 结果与分析
3.1 flg22激发百脉根免疫反应
3.2 根瘤菌激发百脉根免疫反应
3.3 百脉根中根瘤菌预处理抑制flg22 激活的MPK磷酸化
3.4 根瘤菌预处理抑制flg22 激活的免疫反应依赖于SymRK
3.4.1 symrk突变体的鉴定
3.4.2 根瘤菌预处理抑制flg22 激活的MPK磷酸化依赖于SymRK
3.4.3 根瘤菌预处理抑制flg22 激发的ROS依赖于SymRK
3.4.4 根瘤菌预处理抑制flg22 激发的免疫相关基因表达依赖于SymRK
3.5 LjBAK1/SERK3 的鉴定与克隆
3.6 LjBAK1是At BAK1 在百脉根中的同源基因
3.6.1 LjBAK1同源基因的鉴定
3.6.2 LjBAK1 具有与At BAK1 类似的功能
3.7 LjBAK1与SymRK的相互作用
3.8 SymRK抑制LjBAK1 的自磷酸化和底物水平磷酸化
3.9 根瘤菌预处理抑制flg22 介导的BAK1 的磷酸化
3.10 Ljbak1突变体表型分析
3.10.1 CRISPR敲除LjBAK1（由本人及汪涛、刘超合作完成）
3.10.2 Ljbak1突变体发育受阻（由本人及汪涛、刘超合作完成）
3.10.3 LjBAK1参与免疫
3.10.4 LjBAK1负调控共生
3.11 超表达SymRK抑制flg22 介导的免疫反应
4 总结与讨论
4.1 总结
4.2 讨论
4.2.1 根瘤共生早期的免疫抑制
4.2.2 SymRK与 LjBAK1 的相互磷酸化
第三章 百脉根中E3泛素连接酶SIE3调控共生信号机制的研究
1 前言
2 材料与方法
2.1 植物材料
2.2 载体和菌株
2.3 双分子荧光互补（BiFC）
2.4 烟草蛋白表达
2.5 百脉根毛根转化
2.6 酵母双杂交系统
2.7 表达分析
3 结果与分析
3.1 SIE3与SIP1 的相互作用（由本人及袁松丽合作完成）
3.2 SIE3的二聚化
3.3 SIE3第266位半胱氨酸影响其二聚化
3.4 Cys266 影响SIE3 的生物学功能
4 总结与讨论
4.1 总结
4.2 讨论
参考文献
附录一 :本研究所用引物
附录二 :B&D无氮营养液配方
附录三 :论文发表情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Molecular Analysis of Legume Nodule Development and Autoregulation[J]. Brett J. Ferguson,Arief Indrasumunar,Satomi Hayashi,Yu-Hsiang Lin,Dugald E. Reid,Peter M. Gresshoff. Journal of Integrative Plant Biology. 2010(01)
博士论文
[1]泛素连接酶SIE3在百脉根结瘤信号转导中功能及作用机制的研究[D]. 袁松丽.华中农业大学 2013
硕士论文
[1]百脉根泛素连接酶SIE3对共生受体SymRK调控机制的研究[D]. 付伟伟.华中农业大学 2014
本文编号：3152161
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：161 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 研究综述
1.1 共生固氮研究概述
1.1.1 共生固氮的概念与意义
1.1.2 根瘤共生固氮
1.1.3 根瘤的形成过程
1.1.4 豆科植物与根瘤菌间早期信号分子的识别
1.2 植物免疫研究进展
1.2.1 植物的免疫反应
1.2.2 PTI
1.2.3 ETI
1.2.4 PTI与 ETI的协同作用
1.3 LRR类受体蛋白激酶
1.3.1 共生受体激酶SymRK
1.3.2共受体BAK1
1.4 蛋白的泛素化修饰
第二章 豆科共生受体激酶SymRK调控植物免疫防御反应的分子机制
1 前言
1.1 根瘤菌规避植物的PTI
1.2 根瘤菌对植物免疫的调节
1.3 植物自生对免疫的调节
1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 植物材料
2.2 载体和菌株
2.3 百脉根毛根转化
2.3.1 种子的萌发
2.3.2 农杆菌侵染与共培养
2.3.3 毛根鉴定（GUS染色）
2.3.4 毛根鉴定（荧光鉴定）
2.4 百脉根稳定转化
2.4.1 注意事项
2.4.2 相关试剂
2.4.3 种子的萌发
2.4.4 农杆菌侵染与共培养
2.4.5 愈伤筛选
2.4.6 芽诱导
2.4.7 茎诱导茎伸长
2.4.8 根诱导
2.4.9 稳定转化种子的筛选（潮霉素）
2.5 拟南芥花序侵染转化
2.5.1 拟南芥植株的准备
2.5.2 转化菌株的准备
2.5.3 潮霉素筛选种子
2.6 幼苗处理
2.6.1 百脉根幼苗处理
2.6.2 拟南芥幼苗处理
2.6.3 植物蛋白抽提
2.7 植物基因组抽提
2.8 百脉根LORE1突变体鉴定
2.9 表达分析
2.9.1 总RNA的制备
2.9.2 Real-Time PCR
2.10 Gibson等温一步法
2.10.1 Gibson反应液的配置
2.10.2 Gibson法克隆步骤
2.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
2.11.1 主要试剂的配置
2.11.2 主要操作步骤
2.12 WB实验步骤
2.13 原核蛋白表达与纯化
2.13.1 小规模诱导
2.13.2 大规模诱导
2.13.3 蛋白纯化
2.13.4 蛋白超滤
2.14 ROS测定
2.15 磷酸化
2.15.1 SDS–PAGE胶的选择
2.15.2 磷酸化
2.15.3 电泳
2.15.4 压屏
2.15.5 扫屏
2.15.6 注意事项
2.16 酵母双杂交系统
2.16.1 酵母培养基
2.16.2 酵母双杂交相关试剂
2.16.3 醋酸锂（LiAC）高效转化酵母方法
2.16.4 酵母的小范围Mating
2.17 免疫共沉淀
3 结果与分析
3.1 flg22激发百脉根免疫反应
3.2 根瘤菌激发百脉根免疫反应
3.3 百脉根中根瘤菌预处理抑制flg22 激活的MPK磷酸化
3.4 根瘤菌预处理抑制flg22 激活的免疫反应依赖于SymRK
3.4.1 symrk突变体的鉴定
3.4.2 根瘤菌预处理抑制flg22 激活的MPK磷酸化依赖于SymRK
3.4.3 根瘤菌预处理抑制flg22 激发的ROS依赖于SymRK
3.4.4 根瘤菌预处理抑制flg22 激发的免疫相关基因表达依赖于SymRK
3.5 LjBAK1/SERK3 的鉴定与克隆
3.6 LjBAK1是At BAK1 在百脉根中的同源基因
3.6.1 LjBAK1同源基因的鉴定
3.6.2 LjBAK1 具有与At BAK1 类似的功能
3.7 LjBAK1与SymRK的相互作用
3.8 SymRK抑制LjBAK1 的自磷酸化和底物水平磷酸化
3.9 根瘤菌预处理抑制flg22 介导的BAK1 的磷酸化
3.10 Ljbak1突变体表型分析
3.10.1 CRISPR敲除LjBAK1（由本人及汪涛、刘超合作完成）
3.10.2 Ljbak1突变体发育受阻（由本人及汪涛、刘超合作完成）
3.10.3 LjBAK1参与免疫
3.10.4 LjBAK1负调控共生
3.11 超表达SymRK抑制flg22 介导的免疫反应
4 总结与讨论
4.1 总结
4.2 讨论
4.2.1 根瘤共生早期的免疫抑制
4.2.2 SymRK与 LjBAK1 的相互磷酸化
第三章 百脉根中E3泛素连接酶SIE3调控共生信号机制的研究
1 前言
2 材料与方法
2.1 植物材料
2.2 载体和菌株
2.3 双分子荧光互补（BiFC）
2.4 烟草蛋白表达
2.5 百脉根毛根转化
2.6 酵母双杂交系统
2.7 表达分析
3 结果与分析
3.1 SIE3与SIP1 的相互作用（由本人及袁松丽合作完成）
3.2 SIE3的二聚化
3.3 SIE3第266位半胱氨酸影响其二聚化
3.4 Cys266 影响SIE3 的生物学功能
4 总结与讨论
4.1 总结
4.2 讨论
参考文献
附录一 :本研究所用引物
附录二 :B&D无氮营养液配方
附录三 :论文发表情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Molecular Analysis of Legume Nodule Development and Autoregulation[J]. Brett J. Ferguson,Arief Indrasumunar,Satomi Hayashi,Yu-Hsiang Lin,Dugald E. Reid,Peter M. Gresshoff. Journal of Integrative Plant Biology. 2010(01)
博士论文
[1]泛素连接酶SIE3在百脉根结瘤信号转导中功能及作用机制的研究[D]. 袁松丽.华中农业大学 2013
硕士论文
[1]百脉根泛素连接酶SIE3对共生受体SymRK调控机制的研究[D]. 付伟伟.华中农业大学 2014
本文编号：3152161
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/3152161.html
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