甘蔗内生芽孢杆菌的分离鉴定及其促生机制研究

发布时间：2021-04-24 18:21

　　甘蔗是我国最主要的糖料作物,在促进我国蔗区农民增加收入和扩大就业方面发挥着重要作用。广西是中国最大的制糖省,甘蔗种植面积大,病害发生种类多,为害严重。化肥农药的大量使用在一定程度上发挥了重要的作用,但过量施用导致的生产成本攀升及环境污染问题日趋严重,生物菌肥的开发利用为实现甘蔗绿色生产、提质增效提供了重要的保障。本研究通过对甘蔗根内生芽孢杆菌进行分离鉴定,揭示了芽孢杆菌在甘蔗中的种群分布情况,为甘蔗内生芽孢杆菌资源库的构建提供了理论依据。主要研究成果如下:1.通过16S rRNA基因测序,从甘蔗根中共分离鉴定了20株芽孢杆菌,并利用Rep-PCR技术证明甘蔗内生芽孢杆菌具有丰富的表型和遗传多样性。2.芽孢杆菌的促生（PGP）特性实验结果显示,13株（65%）芽孢杆菌能产生IAA,其分泌的IAA产量在11.38-35.74μg.m L^-1之间,产量最高的是Bacillus velezensis Y8;10株（50%）芽孢杆菌能溶解无机磷;5株（25%）芽孢杆菌具有分泌嗜铁素的能力。3.使用8种病原真菌进行拮抗实验,结果发现所有芽孢杆菌都至少对1种病原真菌有抗性,Ba... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 植物根际促生菌（PGPR）
    1.2 芽孢杆菌在国内外的应用情况
    1.3 芽孢杆菌促生及生防作用机制
        1.3.1 芽孢杆菌的促生作用机制
        1.3.2 芽孢杆菌的生防作用机制
    1.4 芽孢杆菌在甘蔗中的应用
    1.5 研究内容
    1.6 研究的目的及意义
2 材料与方法
    2.1 甘蔗内生芽孢杆菌的分离纯化
        2.1.1 分离样品的采集
        2.1.2 甘蔗内生细菌的分离纯化
        2.1.3 促生（PGP）能力检测主要培养基及试剂
        2.1.4 分泌IAA能力检测
        2.1.5 嗜铁能力检测
        2.1.6 磷酸盐溶解能力测定
        2.1.7 16SrRNA基因序列的扩增与系统发育树的构建
    2.2 芽孢杆菌抗真菌活性检测及次生代谢基因筛选
        2.2.1 芽孢杆菌抗病原真菌检测
        2.2.2 芽孢杆菌DNA提取
        2.2.3 次生代谢合成酶基因的筛选
    2.3 芽孢杆菌属指纹图谱分析
        2.3.1 芽孢杆菌基因组DNA提取
        2.3.2 Rep-PCR扩增反应
        2.3.3 Rep-PCR聚类分析
    2.4 Bacillus velezensis Y8 发酵条件优化及抗菌物质提取
        2.4.1 供试培养基及菌株
        2.4.2 种子菌培养
        2.4.3 基础培养基的筛选
        2.4.4 培养基发酵条件的优化
        2.4.5 粗体物制备方法
        2.4.6 抑菌物质热稳定性的测定
        2.4.7 抑菌物质酸碱稳定性测定
    2.5 脂肽化合物的纯化及鉴定
        2.5.1 脂肽类抗生素合成酶相关基因克隆
        2.5.2 硅胶柱层析
        2.5.3 Sephadex LH-20 柱层析
        2.5.4 薄层色谱分析（TLC）
        2.5.5 液质联用分析
    2.6 Bacillus velezensis Y8 对甘蔗的促生及生防作用研究
        2.6.1 Bacillus velezensis Y8 绿色荧光蛋白标记
        2.6.2 Bacillus velezensis Y8 接种甘蔗
        2.6.3 荧光显微镜和扫描电子显微镜检测
        2.6.4 温室试验和细菌的重新分离
        2.6.5 甘蔗几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的测定
        2.6.6 甘蔗黑穗病的分离纯化
        2.6.7 甘蔗黑穗病基因组DNA提取
        2.6.8 甘蔗黑穗病菌的PCR检测
        2.6.9 Bacillus velezensis Y8与甘蔗黑穗病的体外拮抗实验
        2.6.10 温室田间生防实验
3 结果与分析
    3.1 甘蔗内生细菌的分离纯化和鉴定
        3.1.1 芽孢杆菌的分离
        3.1.2 芽孢杆菌系统进化树分析
        3.1.3 芽孢杆菌的促生菌（PGPR）特性
    3.2 芽孢杆菌抗真菌活性检测及次生代谢基因筛选
        3.2.1 芽孢杆菌与真菌的体外拮抗实验检测
        3.2.2 芽孢杆菌的几种次生代谢产物合成酶基因的PCR检测结果
    3.3 芽孢杆菌属指纹图谱分析
        3.3.1 BOX-PCR基因指纹图谱分析
        3.3.2 ERIC-PCR基因指纹图谱分析
        3.3.3 REP-PCR基因指纹图谱分析
        3.3.4 （GTG）5-PCR基因指纹图谱分析
    3.4 Bacillus velezensis Y8 发酵条件优化及抗菌物质提取
        3.4.1 基础培养基筛选结果
        3.4.2 接种量对抗生素产量的影响
        3.4.3 初始pH值对抗生素产量的影响
        3.4.4 培养温度对抗生素产量的影响
        3.4.5 不同转速对抗生素产量的影响
        3.4.6 最佳粗提物制备方法
        3.4.7 温度对抑菌物质稳定性的影响
        3.4.8 酸碱度对抑菌物质稳定性的影响
    3.5 脂肽化合物的纯化及鉴定
        3.5.1 脂肽类基因同源性分析结果
        3.5.2 硅胶柱层析及薄层色谱分析
        3.5.3 Sephadex LH-20 柱结果分析
        3.5.4 液质联用鉴定结果
    3.6 Bacillus velezensis Y8 对甘蔗的促生及生防作用研究
        3.6.1 Bacillus velezensis Y8 在甘蔗中的定殖
        3.6.2 温室促生实验
        3.6.3 接种BacillusvelezensisY8 对甘蔗中几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影响
        3.6.4 Bacillus velezensis Y8 体外拮抗黑穗病结果
        3.6.5 田间生防实验结果
4 讨论
    4.1 甘蔗内生芽孢杆菌的分离纯化和鉴定
    4.2 芽孢杆菌抗真菌活性及次生代谢基因筛选
    4.3 芽孢杆菌属指纹图谱分析
    4.4 Bacillus velezensis Y8 发酵条件优化及抗菌物质提取
    4.5 脂肽化合物的纯化及鉴定
    4.6 Bacillus velezensis Y8 对甘蔗的促生及生防作用研究
5 结论
    5.1 全文总结
    5.2 论文创新点
    5.3 问题与展望
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
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本文编号：3157840