水杨酸在喜树悬浮细胞培养中的作用及转CaSAT喜树的初步构建

发布时间：2021-05-13 21:04

　　喜树（Camptotheca acuminata）是中国一种独特的树种。通过组织培养,特别是通过遗传转化和基因工程的手段,对提高该药用植物的喜树碱含量具有重要意义。本实验以喜树的幼嫩叶片和茎段为材料,探讨MS、WPM基本培养基和不同激素（2,4-D、IBA、6-BA、IAA）配比对愈伤组织诱导及继代培养的影响,并筛选喜树细胞悬浮培养体系的最佳培养基配方。利用喜树愈伤组织构建悬浮细胞体系,并应用不同浓度SA进行不同时长的处理检测悬浮细胞中喜树关键酶基因表达量。初步建立通过根癌农杆菌GV3101介导的喜树水杨酸转运基因CaSAT基因的遗传转化系统,结果表明:1.喜树幼嫩叶片外植体诱导愈伤培养以WPM+2,4-D 0.15 mg/L+6-BA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L,pH 5.8为最优。继代培养以MS+2,4-D 0.15 mg/L+6-BA 0.6mg/L为最适。2.通过对喜树诱导愈伤组织,成功建立了喜树愈伤组织悬浮细胞的体系,并对培养基进行了改良,确定喜树愈伤组织悬浮细胞培养基为MS+2,4-D 0.15 mg/L+6-BA 0.6mg/L+IAA 0.25 mg/L+蔗糖3... 

【文章来源】：大连工业大学辽宁省

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 喜树
        1.1.1 喜树简介
        1.1.2 喜树的应用价值
        1.1.3 研究进展
        1.1.4 喜树碱及其应用价值
        1.1.5 喜树碱代谢途径
    1.2 组织培养及其影响因素
        1.2.1 组织培养定义
        1.2.2 实现植物再生的途径
        1.2.3 影响因素
    1.3 水杨酸与水杨酸转运蛋白
        1.3.1 水杨酸及其生理意义
        1.3.2 水杨酸与植物的次生代谢
        1.3.3 转运蛋白
        1.3.4 水杨酸转运基因的发现和功能
    1.4 喜树的悬浮培养
    1.5 愈伤组织的诱导与分化
    1.6 木本植物遗传转化
        1.6.1 木本植物遗传转化特点
        1.6.2 影响木本植物遗传转化的因素
        1.6.3 木本植物转化系统及方法
        1.6.4 增加喜树中喜树碱含量的代谢工程
        1.6.5 SAT基因的遗传转化
    1.7 本实验的目的与意义
第二章 喜树再生体系的构建
    2.1 实验材料与仪器
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 激素的配制
        2.2.2 培养基的配制
        2.2.3 喜树的组织培养方法
        2.2.4 培养基的改良
        2.2.5 无菌苗的炼苗移栽
    2.3 结果与分析
        2.3.1 外植体消毒
        2.3.2 组培苗的生根诱导
        2.3.3 组培苗的芽苗增殖诱导
        2.3.4 培养基的改良
        2.3.5 无菌苗的炼苗移栽
    2.4 小结
第三章 水杨酸在喜树悬浮细胞培养中的作用
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 实验仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 培养基
        3.2.2 喜树愈伤组织的诱导
        3.2.3 喜树悬浮细胞体系的构建
        3.2.4 细胞再生能力的鉴定
        3.2.5 培养基的改良
        3.2.6 HPLC法检测喜树碱含量
        3.2.7 q-RTPCR检测SA对喜树悬浮细胞关键酶基因表达量的影响
        3.2.8 喜树悬浮细胞RNA的提取及反转录
        3.2.9 实时荧光定量PCR检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 两种不同培养基上喜树愈伤的诱导对比
        3.3.2 喜树愈伤悬浮细胞体系的构建
        3.3.3 液相检测喜树不同部位CPT含量
        3.3.4 喜树悬浮细胞RNA的提取
        3.3.5 q-RT-PCR检测SA对喜树悬浮细胞基因表达量的影响
    3.4 小结
第四章 转CASAT喜树的初步构建
    4.1 材料与仪器
        4.1.1 材料
        4.1.2 菌种
        4.1.3 试剂
        4.1.4 仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 试剂的处理
        4.2.2 培养基
        4.2.3 细菌培养条件
        4.2.4 农杆菌的培养
        4.2.5 预培养
        4.2.6 侵染
        4.2.7 脱菌(外植体清洗办法)
        4.2.8 诱导抗性愈伤组织
        4.2.9 抗性愈伤组织的筛选
        4.2.10 生根培养
        4.2.11 芽苗增殖与壮苗培养
    4.3 结果与分析
        4.3.1 外植体的预培养
        4.3.2 外植体的侵染
        4.3.3 侵染后外植体的脱菌
        4.3.4 抗性愈伤组织的诱导及筛选
        4.3.5 抗性愈伤组织的生根分化
        4.3.6 抗性愈伤的芽苗增殖分化
    4.4 小结
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]超声、DMSO和CMC-Na处理对喜树细胞悬浮培养的影响[J]. 康大力,夏黎,张洪利.  海峡药学. 2014(04)
[2]喜树果中喜树碱和羟基喜树碱的快速分离[J]. 戴汉松,王家文,王涛.  中国西部科技. 2013(05)
[3]根癌农杆菌介导CMO基因在96-Ⅱ喜树中的遗传转化[J]. 董凤丽,王慧梅,祖元刚.  江苏农业科学. 2013(04)
[4]喜树叶中喜树碱和10-羟基喜树碱的HPLC分析（英文）[J]. 李香莉,肖凯军,胡先运,罗心毅,郭祀远.  吉首大学学报(自然科学版). 2009(05)
[5]HPLC法测定不同产地喜树果中喜树碱[J]. 黄瑞松,叶云锋,梁启成,周芳礼,苏青,付小红,林翠悟.  中草药. 2009(01)
[6]HPLC法测定喜树幼枝中喜树碱含量[J]. 王玲丽,马沛勤,刘文哲.  药物分析杂志. 2008(09)
[7]喜树幼苗中喜树碱及其代谢相关酶类的分布[J]. 孙世芹,阎秀峰.  中草药. 2008(08)
[8]光照对喜树愈合组织生理及喜树碱合成的影响[J]. 顾青,朱睦元.  浙江林学院学报. 2006(03)
[9]喜树叶片中喜树碱含量的季节变化研究[J]. 郭勇,林桂芸,孙雁霞,邬晓勇,石大兴.  西南农业学报. 2006(01)
[10]石杉科植物石杉总碱含量的测定及基于紫外光谱的除趋势对应分析[J]. 方芳,郭水良,李沛玲,卢文广.  武汉植物学研究. 2005(06)

博士论文
[1]喜树细胞培养体系的建立与喜树异碱A和B的生物合成及过程调控[D]. 于放.大连理工大学 2005
[2]喜树组织培养与遗传转化的研究[D]. 王慧梅.东北林业大学 2004

硕士论文
[1]大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D]. 韩秀丽.山东农业大学 2013
[2]喜树高效再生体系的建立与农杆菌介导的遗传转化研究[D]. 杨国峥.贵州大学 2007
[3]外源水杨酸对喜树幼苗中喜树碱含量的影响[D]. 黄永鑫.东北林业大学 2007
[4]喜树愈伤组织和叶片中喜树碱含量变化研究[D]. 郭勇.四川农业大学 2005
[5]喜树、丹参组织细胞培养的研究[D]. 田宇红.陕西师范大学 2003
[6]喜树悬浮培养细胞生理特性的初步研究[D]. 高桂珍.华中师范大学 2003
[7]喜树细胞培养体系的建立及培养动力学[D]. 于放.大连理工大学 2001



本文编号：3184702