藜麦不同U6启动子的克隆与功能分析及靶向CqASMT12基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建
发布时间：2021-07-05 08:47
藜麦（Chenopodium quinoa.Wild）是盐生植物,因其独特的生物学特性及全面的营养价值逐渐成为越来越多生物学家的研究对象。随着藜麦全基因组序列信息的解析,越来越多藜麦功能基因逐渐被克隆,但用于藜麦的CRISPR/Cas9基因组编辑体系还未见报道,这一定程度上限制了藜麦的基因功能研究。乙酰-5-羟色胺甲基转移酶（Acetylserotonin methyltransferase,ASMT）是褪黑素生物合成的最后一种酶,在植物褪黑激素的产生中起着限速作用,编码ASMT蛋白的基因通常以多基因家族的形式存在,近年来越来越多研究表明,提高ASMT基因的表达水平可以提高植物对逆境抗性,但ASMT基因突变后的表型及生理影响还不清楚。为此,本研究开展了三部分的工作,首先对藜麦原生质体瞬时表达的条件进行了摸索确定,为筛选构建藜麦CRISPR/Cas9系统所需的U6启动子奠定基础;其次,对藜麦不同U6启动子进行克隆,构建表达载体筛选高转录活性的藜麦U6启动子;最后对藜麦ASMT基因家族进行系统分析,确定了ASMT靶标基因,并利用筛选得到的U6启动子构建藜麦ASMT基因的CRISPR/Cas...
【文章来源】：烟台大学山东省
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统结构
烟台大学硕士学位论文13图2高等植物褪黑素的合成和代谢途径（王蕊等2016）Figure2Biosynthesisandmetabolismpathwayofmelatonininhigherplant3.3植物中褪黑素合成基因ASMT的研究进展褪黑素生物合成的最后一步由ASMT催化,该酶和动物褪黑素合成途径中HIOMT高度同源。Kang等首次在水稻中克隆了ASMT,序列分析表明该酶属于O-甲基转移酶家族,其中18个编码OMT的cDNA与小麦COMT高度同源，将这些cDNA与大肠杆菌重组并进行表达,发现只有AK072740基因具有合成褪黑素的能力,进一步研究表明衰老和外源胁迫因素可以诱导ASMT的表达[93]。在烟草中异源过量表达AANAT和HIOMT基因可以提高烟草褪黑素含量，并一定程度缓解UVB对DNA造成的损伤[94]。Park等首次在大肠杆菌中纯化了水稻OsASMT并进行了酶动力学分析,发现黑暗环境下褪黑素含量显著高于光照,并且这种上调与OsASMT的表达相一致，这表明植物中ASMT基因的表达可能与动物中类似，受到光周期或昼夜节律的调节[95]。随后对水稻ASMT基因家族的ASMT1(AK072740)、ASMT2(AK069308)及ASMT3(AAL34945)进行的功能分析表明,这3个基因的表达均受ABA和MeJA的诱导,但是这些ASMT的催化活性处于较低水平,因此不适宜通过调控这些酶的表达或外源转入相关基因来提高植物褪黑素含量[96]。Zuo等克隆了编码苹果ASMT的基
第一章藜麦原生质体瞬时转化体系的建立20量才能达到合适水平。本实验比较了0.4-0.8M甘露醇作为稳渗剂制备原生质体的效果，结果（图2-1图2-2）表明：低甘露醇浓度下（0.4M-0.5M）,原生质体的产量较低，存活率也处于较低水平，部分细胞在洗涤过程中因吸水而涨破；当甘露醇浓度达到0.6M时，原生质体细胞内外渗透压趋于平衡，原生质体的产量达到峰值，活性最高，原生质体形态饱满，叶绿体分布均匀，洗涤过程中只有少量破损；当甘露醇浓度继续增加，原生质体的产量和活性均开始下降，部分细胞因失水而皱缩。综上，0.6M甘露醇作为藜麦原生质体制备过程中的稳渗剂最佳。图2-1不同甘露醇浓度下原生质体产率和存活率Figure2-1Theyieldandviabilityofprotoplastawithdifferentmannitolconcentrations注：酶成分为1.5%纤维素酶+0.3%离析酶，酶解时间为8h图中数据为3次重复的平均值±SD图2-2不同甘露醇浓度下原生质体形态Figure2-2Themorphologyofprotoplastswithdifferentmannitolconcentrations
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J]. 刘耀光,李构思,张雅玲,陈乐天. 华南农业大学学报. 2019(05)
[2]番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J]. 蒲艳,刘超,李继洋,阿尔祖古丽·塔什,胡燕,刘晓东. 中国农业科学. 2018(02)
[3]Rapid generation of genetic diversity by multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in rice[J]. Lan Shen,Yufeng Hua,Yaping Fu,Jian Li,Qing Liu,Xiaozhen Jiao,Gaowei Xin,Junjie Wang,Xingchun Wang,Changjie Yan,Kejian Wang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[4]高等植物褪黑素的合成和代谢研究进展[J]. 王蕊,杨小龙,须晖,李天来. 植物生理学报. 2016(05)
[5]棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定[J]. 雷建峰,李月,徐新霞,阿尔祖古丽·塔什,蒲艳,张巨松,刘晓东. 作物学报. 2016(05)
[6]植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析[J]. 马兴亮,刘耀光. 遗传. 2016(02)
[7]木本植物原生质体培养体系研究进展[J]. 彭邵锋,陆佳,陈永忠,王瑞,陈隆升,马力,王湘南. 中国农学通报. 2013(01)
[8]植物组织培养技术及其在生产上的应用[J]. 刘永立,林颖. 新农村. 2011(06)
[9]荔枝转基因悬浮细胞再生松散性胚性愈伤组织的原生质体分离与初步培养[J]. 赖呈纯,赖钟雄,黄浅,桑庆亮. 亚热带农业研究. 2007(02)
[10]刺葡萄原生质体分离研究[J]. 吕长平,石雪晖,徐艳,叶云. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2005(04)
博士论文
[1]CRISPR-Cas9介导的玉米基因组定点编辑研究[D]. 朱金洁.中国农业大学 2015
[2]基于CRISPR/Cas9的拟南芥多基因编辑及其在基因功能研究中的应用[D]. 刘玟杉.重庆大学 2015
硕士论文
[1]百合原生质体分离及培养的研究[D]. 柳玉晶.东北农业大学 2006
本文编号：3265755
【文章来源】：烟台大学山东省
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统结构
烟台大学硕士学位论文13图2高等植物褪黑素的合成和代谢途径（王蕊等2016）Figure2Biosynthesisandmetabolismpathwayofmelatonininhigherplant3.3植物中褪黑素合成基因ASMT的研究进展褪黑素生物合成的最后一步由ASMT催化,该酶和动物褪黑素合成途径中HIOMT高度同源。Kang等首次在水稻中克隆了ASMT,序列分析表明该酶属于O-甲基转移酶家族,其中18个编码OMT的cDNA与小麦COMT高度同源，将这些cDNA与大肠杆菌重组并进行表达,发现只有AK072740基因具有合成褪黑素的能力,进一步研究表明衰老和外源胁迫因素可以诱导ASMT的表达[93]。在烟草中异源过量表达AANAT和HIOMT基因可以提高烟草褪黑素含量，并一定程度缓解UVB对DNA造成的损伤[94]。Park等首次在大肠杆菌中纯化了水稻OsASMT并进行了酶动力学分析,发现黑暗环境下褪黑素含量显著高于光照,并且这种上调与OsASMT的表达相一致，这表明植物中ASMT基因的表达可能与动物中类似，受到光周期或昼夜节律的调节[95]。随后对水稻ASMT基因家族的ASMT1(AK072740)、ASMT2(AK069308)及ASMT3(AAL34945)进行的功能分析表明,这3个基因的表达均受ABA和MeJA的诱导,但是这些ASMT的催化活性处于较低水平,因此不适宜通过调控这些酶的表达或外源转入相关基因来提高植物褪黑素含量[96]。Zuo等克隆了编码苹果ASMT的基
第一章藜麦原生质体瞬时转化体系的建立20量才能达到合适水平。本实验比较了0.4-0.8M甘露醇作为稳渗剂制备原生质体的效果，结果（图2-1图2-2）表明：低甘露醇浓度下（0.4M-0.5M）,原生质体的产量较低，存活率也处于较低水平，部分细胞在洗涤过程中因吸水而涨破；当甘露醇浓度达到0.6M时，原生质体细胞内外渗透压趋于平衡，原生质体的产量达到峰值，活性最高，原生质体形态饱满，叶绿体分布均匀，洗涤过程中只有少量破损；当甘露醇浓度继续增加，原生质体的产量和活性均开始下降，部分细胞因失水而皱缩。综上，0.6M甘露醇作为藜麦原生质体制备过程中的稳渗剂最佳。图2-1不同甘露醇浓度下原生质体产率和存活率Figure2-1Theyieldandviabilityofprotoplastawithdifferentmannitolconcentrations注：酶成分为1.5%纤维素酶+0.3%离析酶，酶解时间为8h图中数据为3次重复的平均值±SD图2-2不同甘露醇浓度下原生质体形态Figure2-2Themorphologyofprotoplastswithdifferentmannitolconcentrations
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J]. 刘耀光,李构思,张雅玲,陈乐天. 华南农业大学学报. 2019(05)
[2]番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J]. 蒲艳,刘超,李继洋,阿尔祖古丽·塔什,胡燕,刘晓东. 中国农业科学. 2018(02)
[3]Rapid generation of genetic diversity by multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in rice[J]. Lan Shen,Yufeng Hua,Yaping Fu,Jian Li,Qing Liu,Xiaozhen Jiao,Gaowei Xin,Junjie Wang,Xingchun Wang,Changjie Yan,Kejian Wang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[4]高等植物褪黑素的合成和代谢研究进展[J]. 王蕊,杨小龙,须晖,李天来. 植物生理学报. 2016(05)
[5]棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定[J]. 雷建峰,李月,徐新霞,阿尔祖古丽·塔什,蒲艳,张巨松,刘晓东. 作物学报. 2016(05)
[6]植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析[J]. 马兴亮,刘耀光. 遗传. 2016(02)
[7]木本植物原生质体培养体系研究进展[J]. 彭邵锋,陆佳,陈永忠,王瑞,陈隆升,马力,王湘南. 中国农学通报. 2013(01)
[8]植物组织培养技术及其在生产上的应用[J]. 刘永立,林颖. 新农村. 2011(06)
[9]荔枝转基因悬浮细胞再生松散性胚性愈伤组织的原生质体分离与初步培养[J]. 赖呈纯,赖钟雄,黄浅,桑庆亮. 亚热带农业研究. 2007(02)
[10]刺葡萄原生质体分离研究[J]. 吕长平,石雪晖,徐艳,叶云. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2005(04)
博士论文
[1]CRISPR-Cas9介导的玉米基因组定点编辑研究[D]. 朱金洁.中国农业大学 2015
[2]基于CRISPR/Cas9的拟南芥多基因编辑及其在基因功能研究中的应用[D]. 刘玟杉.重庆大学 2015
硕士论文
[1]百合原生质体分离及培养的研究[D]. 柳玉晶.东北农业大学 2006
本文编号：3265755
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