烟草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因（NtDXR）的过表达研究

发布时间：2021-08-23 17:53

　　萜类是烟草重要的香气物质和前体物。为调控烟草萜类的合成,将前期克隆的烟草NtDXR基因,分别进行组织型过表达和腺毛特异性过表达,经DNA-PCR、RT-PCR、Southern Blot、GUS染色、qPCR检测,获得阳性株系,并进行表型检测、生理指标检测和基因表达分析。主要研究结果如下:1、将NtDXR融合绿色荧光蛋白（GFP）,通过农杆菌介导法在烟草中瞬时表达NtDXR基因,检测烟叶表皮细胞的绿色荧光,亚细胞定位结果显示,NtDXR基因定位于叶绿体。2、构建NtDXR基因的组成型过表达载体（pCAMBIA-35S-NtDXR-GUS）和腺毛特异过表达载体（pCAMBIA1391-CYP-NtDXR-GUS）,通过农杆菌介导法转入烤烟品种K326,经卡那抗性筛选获得烟株,对转基因烟株进行DNA-PCR、RT-PCR检测,筛选出NtDXR过表达阳性转基因株系。对NtDXR转基因株系的烟叶进行GUS染色,结果显示,35S-NtDXR烟叶各组织均染成蓝色,CYP-NtDXR烟叶只有腺毛染成蓝色。3、对阳性NtDXR转基因株系进行Southern blot分析,结果显示,获得的NtDXR组成... 

【文章来源】：河南农业大学河南省

【文章页数】：44 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

萜类化合物的结构式

4发现，如果抑止拟南芥的MVA途径，MEP途径就会补充细胞质中MVA途径代谢流的减少。如今我们已经知晓，单萜、二萜、四萜以及某些异戊二烯的醌类基本通过MEP途径在质体中获得，而倍半萜、三萜等大都通过细胞质中的MVA途径获得[31]。但是，最近有些试验认为这两条途径合成的萜类物质并不是绝对不变的。比如，番茄和青蒿腺毛中的MEP途径也能合成倍半萜[32-33]，而巴豆的MEP途径的产物中则出现了三萜[34]。MVA途径也能合成穿心莲内酯(一种二萜内酯化合物)的前体物[35]。此外，虽然IPP大多在细菌、藻类和植物体的MEP途径形成，但在古细菌、真菌和动物体内则是经由MVA途径获得[36-37]。虚线表示由多步反应完成图2植物萜类生物合成的两条途径1.2.2MEP途径关键酶研究进展MEP途径中研究最多的是DXS和DXR酶。DXS基因最初是在大肠杆菌中分离出来的[38]，之后又从薄荷[39]、胡椒[40]以及其他细菌[41]中分离出DXR的同源基因。这几年的探索证明，植物和细菌中存在两个或者多个DXS基因[42]，这表示该基因是以家族形式存在的[43]。金蓉等[44]已经研究了DXS在MEP途径中的功能、DXS的构造、亚细胞定位、酶活性、编

164结果与分析4.1亚细胞定位DXR基因是萜类合成MEP途径的关键酶，该途径在质体中进行，为了了解烟草NtDXR在细胞中的定位情况，将NtDXR与GFP融合，连接在CaMV35S启动子的下游，在烟草叶片中瞬时表达，通过共聚焦激光扫描显微镜观察GFP绿色荧光在细胞中的分布，确定NtDXR基因在细胞中的表达部位。如图3示，NtDXR-GFP融合蛋白激发的绿色荧光与叶绿素激发的红色荧光位置重合，因此NtDXR定位于叶绿体。图3亚细胞定位图a:融合蛋白绿色荧光;b:叶绿素自发荧光;c:合并影像;d:明场像比例尺：20μm4.2NtDXR基因在烟草中的过表达4.2.1载体检测4.2.1.1组成型过表达载体pCAMBIA-35S-NtDXR–GUS检测将已构建好的载体pCAMBIA-35S-NtDXR–GUS进行PCR检测，结果如图4A。然后用热激法将组成型过表达载体pCAMBIA-35S-NtDXR–GUS，转入农杆菌EHA105，挑取单菌落扩大培养并进行菌液PCR检测，电泳结果见图4B，阳性菌液可用来转化无菌苗。图4PCR检测(A)M:markerDL2000;1:阴性对照;2:pCAMBIA-35S-NtDXR–GUS载体(B)M:markerDL2000;1:质粒;2:阴性对照;3-4:农杆菌菌液4.2.1.2腺毛特异性过表达载体pCAMBIA1391-CYP-NtDXR-GUS检测将已构建好的载体pCAMBIA1391-CYP-NtDXR-GUS进行PCR检测，结果如图5A。用熱激法将腺毛特异性过表达载体pCAMBIA1391-CYP-NtDXR-GUS，转入农杆菌EHA105，挑取单菌落扩大培养并进行菌液PCR检测，电泳结果见图5B，阳性菌液可用来转化无菌苗。(A)(B)(A)(B)

【参考文献】：
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本文编号：3358325