CRISPR/Cas9介导的茶树基因组编辑技术体系的构建

发布时间：2021-08-24 17:54

　　CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。本论文以茶树咖啡因合成酶编码基因（TCS）为靶基因,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树TCS双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体。与此同时,对茶树遗传转化与再生体系进行了优化,并将TCS靶向的CRISPR/Cas9基因编辑载体导入茶树细胞进行了表达。本文主要研究结果如下:1、构建了茶树咖啡因合成酶基因组编辑载体根据TCS基因组序列设计了两个靶序列T1和T2,并合成相应引物,以pYLgRNA-AtU3d-LacZ载体为模板通过常规PCR扩增技术获得U3d启动子和连接T1靶序列的T1-gRNA片段,以pYLgRNA-AtU3b为模板通过常规PCR扩增技术获得U3b启动子和连接T2靶序列的T2-gRNA片段;采用Overlapping PCR技术将U3d启动子片段和T1-gRNA片段连接在一起组装成T1sgRNA表达盒,采用同样的技术将U3b启动子片段和T2-gRNA片段一起组装... 

【文章来源】：湖南农业大学湖南省

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 CRISPR/Cas9系统
        1.1.1 CRISPR/Cas9系统的发展历史
        1.1.2 CRISPR/Cas9系统结构与作用原理
        1.1.3 CRISPR/Cas9与其它常用基因组编辑技术的比较
        1.1.4 CRISPR/Cas9系统在各类常见经济作物上的应用
    1.2 茶树再生体系研究进展
        1.2.1 茶树组织培养研究进展
        1.2.2 生根培养
        1.2.3 茶树组织培养中的影响因素
    1.3 茶树遗传转化研究进展
        1.3.1 农杆菌介导茶树的遗传转化
        1.3.2 其它遗传转化技术
    1.4 研究目的及意义
    1.5 研究内容
        1.5.1 CRISPR/Cas9载体的构建
        1.5.2 茶树组织培养再生体系的优化
        1.5.3 茶树遗传转化体系的优化
        1.5.4 分子检测
第二章 茶树咖啡因合成酶基因组编辑载体的构建
    2.1 材料与方法
        2.1.1 质粒、引物、菌种与试剂
        2.1.2 sgRA序列设计及分析
        2.1.3 sgRNA表达盒构建方法
        2.1.4 组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体
        2.1.5 酶切-连接产物的转化与质粒提取
    2.2 结果与分析
        2.2.1 sgRNA设计
        2.2.2 质粒提取
        2.2.3 sgRNA表达盒的构建
        2.2.4 两个sgRNA表达盒的拼接及与Cas9双元表达载体的组合
        2.2.5 测序验证
    2.3 小结与讨论
第三章 茶树组织培养再生体系的优化
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 试验方法
    3.2 结果与分析
        3.2.1 不同培养基对茶树无菌苗培养的影响
        3.2.2 不同植物生长调节剂对茶树脱分化效果的影响
        3.2.3 不同外植体对茶树脱分化效果的影响
        3.2.4 不同茶树品种对茶树脱分化的影响
        3.2.5 不定芽诱导培养基的选择
        3.2.6 生根培养
    3.3 小结与讨论
第四章 茶树咖啡因合成酶基因组编辑载体的遗传转化
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 不同外植体对转化效率的影响
        4.2.2 转基因筛选浓度的选择
        4.2.3 农杆菌抑制剂浓度的选择
        4.2.4 农杆菌的浓度对转化效率的影响
        4.2.5 乙酰丁香酮(As)对转化效率的影响
        4.2.6 茶树体细胞胚DNA提取
        4.2.7 转基因茶树体细胞胚的PCR验证
        4.2.8 抗性体细胞胚DNA测序
    4.3 小结与讨论
第五章 总结与展望
    5.1 主要研究成果
    5.2 主要创新点
    5.3 展望
参考文献
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展[J]. 单奇伟,高彩霞.  遗传. 2015(10)
[2]不同成熟度茶籽外植体诱导发生体胚的研究[J]. 李晓东,向勤锃,高吉刚,张丽霞.  中国农学通报. 2010(18)
[3]花粉管通道法对茶树进行dsTCS基因转化的初步研究[J]. 李玲玲,江昌俊,房婉萍,邓威威.  安徽农业大学学报. 2007(01)
[4]茶树愈伤组织诱导和组织培养[J]. 杨国伟,兰蓉,王晓杰,辛秀兰.  江苏农业科学. 2006(04)
[5]不同激素配比对茶树苗组织培养的影响[J]. 王云.  安徽农业科学. 2006(14)
[6]发根农杆菌转化茶树的研究[J]. 彭正云,刘德华,肖海军,蒋立文,张丽霞,向勤锃,唐道方.  湖南农业大学学报(自然科学版). 2006(02)
[7]茶树组培快繁技术的优化研究[J]. 周健,成浩,王丽鸳.  茶叶科学. 2005(03)
[8]薮北茶的组织培养[J]. 张娅婷,张伟.  周口师范学院学报. 2004(05)
[9]不同品种茶树愈伤组织的培养与茶氨酸的积累[J]. 袁弟顺,林丽明,孙威江,林金科.  福建农业大学学报. 2004(02)
[10]茶树的组培快繁技术初探[J]. 张建华,毛平生,彭火辉.  蚕桑茶叶通讯. 2003(04)

博士论文
[1]农杆菌及基因枪介导的茶树外源基因导入体系优化研究[D]. 吴姗.浙江大学 2004

硕士论文
[1]茶树组织培养再生体系优化与遗传转化的研究[D]. 许益娟.南京农业大学 2012
[2]茶氨酸生物合成研究[D]. 高秀清.中国农业科学院 2002



本文编号：3360453