小麦Tae-miR0078-3p的克隆及其在低磷胁迫中的功能研究

发布时间：2021-08-28 00:19

　　植物MicroRNA（miRNA）是一类内源性的非编码小分子RNA,它们参与调节植物生长、发育和代谢过程中多种基因的表达。近期的研究发现miRNA参与调节磷的吸收和利用,影响了植物对低磷胁迫的适应能力。在我们的前期研究中,通过高用量测序分析发现,miR0078-3p在低磷胁迫小麦（CS）地下部分里差异表达。本研究克隆小麦miR0078-3p前体（pre-MIR0078-3p）,构建过表达水稻植株,并且研究其功能。主要研究结果如下:1.根据小麦基因组序列,PCR克隆得到包含有Tae-miR0078-3p前体结构的序列。2.成功构建了植物表达载体pOx-pre-miR0078-3p,抗生素标记为潮霉素。3.利用农杆菌介导的水稻遗传转化获得抗潮霉素（Hyg）的水稻植株。4.对得到的抗性植株进行PCR分子鉴定,获得8株mi R0078-3p阳性水稻。q RT-PCR检测成熟体miR0078-3p在转基因水稻中的表达量与野生型相比,PCR阳性植株MIR0078-3p表达量显著增高。5.对miR0078-3p过表达植株和野生型水稻的靶基因OsILR1进行了表达分析。结果表明,miR0078-3p基... 

【文章来源】：哈尔滨师范大学黑龙江省

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【部分图文】：

植物miRNA产生和调控途径[43]

第2章Tae-miR0078-3p基因的克隆-17-素50mg/ml），留甘油菌，-80℃保存。pMD18T-MIR0078-3p质粒4μl10×BufferM1μlBmaHIPstI0.5μl0.5μlH2O4μlTotal10μl酶切反应条件：37℃，30min。2.2.2.6MIR0078-3p前体基因的测序及生物信息学分析将pre-miR0078-3p核苷酸序列的测序结果通过NCBI可以获得Blast结果，并和小麦基因组进行比对。运用在线软件Mfold（http//mfold.ma.albany.edu/）对这段序列进行二级结构预测。2.3实验结果2.3.1小麦MIR0078-3p基因的克隆小麦总DNA的提取，如图2-1图2-1小麦总DNA电泳图Fig.2-1ElectrophoregramoftotalDNAfromwheatM：BM2000+；1-8：小麦DNAM:BM2000+;1-8:wheatDNA通过对低磷胁迫小麦地下部分的高通量测序数据中得到上调表达的MIR0078-3p基因的核苷酸序列。根据其前体序列通过小麦基因组网站进行序列比对设计引

哈尔滨师范大学硕士学位论文-18-物，进行PCR扩增，扩增产物大小约500bp（图2-2）。图2-2PCR扩增小麦MIR0078-3p基因图Fig.2-2PCRamplificationofMIR0078-3pgeneM：BM2000+；1-5：MIR0078-3p基因M:BM2000+;1-5:MIR0078-3pgene2.3.2pMD18T-MIR0078-3p克隆载体的构建对MIR0078-3p基因的PCR产物片段进行胶回收并连接到pMD18-T载体中。此时得到重组质粒，使用热激转化到感受态大肠杆菌TOP10中，对其PCR筛选，将利用BmaHI和PstI对提取的阳性菌质粒进行双酶切验证（图2-3）。阳性菌株送于生工生物公司进行测序。图2-3pMD18T-MIR0078-3p质粒双酶切鉴定结果Fig.2-3IdentificationofrecombinantplasmidspMD18T-MIR0078-3pBmaHI/PstI

【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]水稻OsARF16介导的生长素信号参与调控磷饥饿响应[D]. 沈晨佳.浙江大学 2011



本文编号：3367397