油菜及其近缘种不同组织花青素累积的分子机制研究
发布时间：2021-09-28 08:15
花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素,属于黄酮类的次生代谢物。花青素具有较强的抗氧化特性,其在植物抵抗生物和非生物逆境以及人类延缓衰老、癌症治疗等健康领域中具有重要作用。甘蓝型油菜（Brassica napus L.,2n=38）中富含花青素的种质资源缺乏,有关花青素合成基因的报道较少。利用芸薹属近缘种转录组测序研究花青素转录调控及通过远缘杂交创建富含花青素的甘蓝型油菜新资源、进行花青素相关基因的克隆及功能解析,对油菜的多功能利用具有重要意义。本实验室在小白菜（B.rapa L.ssp.chinesis）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus（L.）O.E.Schulz）和甘蓝型油菜的复合杂交后代中选育出表型为紫色植株的甘蓝型油菜渗入系,命名为紫色油菜（Purple rapeseed,PR）。本研究解析了调控PR叶片花青素合成关键基因Bna PAP2.A7的表达特性及其不同转录本的功能,精细定位并克隆了紫秆性状的基因Bna PAP2.C6.a,并对上述基因的同源性、进化关系和在PR不同组织部位表达模式进行了分析。同时,本实验室收集了紫罗兰（Matthi...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
花青素代谢通路基因转录调控模式（Xuetal2014）
油菜及其近缘种不同组织花青素累积的分子机制研究11图3通过活性WBM复合物与无活性或抑制性WBM复合物之间的定量竞争调节拟南芥细胞中的花色素苷产生（Shi&Xie2014）Fig.3RegulationofanthocyaninproductioninArabidopsiscellsbyquantitativecompetitionbetweenactiveWBMcomplexesandinactiveorrepressiveWBMcomplexes(Shi&Xie2014)1.3.4芸薹属花青素代谢相关基因研究进展芸薹属植物中包含重要的油料作物甘蓝型油菜、芥菜型油菜及蔬菜白菜、甘蓝等。芸薹属二倍体白菜、甘蓝均发现有较多的变异类型，包括绿叶和紫叶的变异。在白菜中，洪山菜薹、紫白菜等均因富含花青素而表现为紫红色或紫色。在甘蓝中，也有紫包菜、紫色花椰菜等富含花青素的变异类型。同时，芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥中也存在紫色叶片的变异类型。在白菜中，研究者利用洪山菜薹（也称紫菜薹）和紫叶小白菜为研究对象，开展了一些研究。白菜中花青素相关基因定位最早由Burdzinski和Wendell（2007）报道了位于R9block的基因anl。随后，Hayashi等（2010）利用DH系紫叶材料（Iyo-hikabu）和绿叶材料（Y54）定位了另外一个花青素基因位点Anp，位于R9block。Zhou等（2013）利用红白菜Tsuda为研究材料，证明CHS基因是合成类黄酮和花青素的关键基因。Ahmed等（2015）以红叶白菜（Palgangbaechu）、部分红色白菜（8053）和绿白菜（Seoulbaechu）为研究对象，利用冷害和冻害胁迫处理，鉴定到LDOX基因在冷害和冻害处理下与TT8及MYB2存在互作，调控花青素的合成。Guo等（2015）利用紫菜薹和绿色菜薹为研究材料，进行了花青素切片观察和QTL分析，使用161个InDel标记构建了200个F2株系的遗传连锁图谱，结合F2表型数据，在A09染色体上鉴定了一个能解释56.7%表型变异的主效QTL，这一位点包
华中农业大学2020届博士研究生学位（毕业）论文22PAP2的CDS序列通过BamHI-SmaI限制性内切酶位点和改造的pDOE-20相连（图4B）作为BnaPAP2.A7蛋白亚细胞定位的对照。将构好的载体热击转化大肠杆菌DH10B，挑选单克隆进行菌落PCR检测，检测带型准确的单克隆送天一辉远公司测序，测序序列准确的单克隆菌液提取质粒后电击转化农杆菌载体GV3101，挑选单克隆用于菌液PCR检测，检测带型准确的农秆载体用于后续侵染实验。将含有融合表达蛋白的农杆菌接种到三抗LB培养基（含Kan、Gen、Rif抗生素）28℃培养16h左右，收集菌体用悬浮液（10mMMES-KOH，10mMMgCl2，150mMAcetosyringone，pH=5.6）悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.4，然后将调整好的菌液注射到4-6周的烟草幼苗叶片内。四天后，取注射过农杆菌的烟草叶片用剪刀剪成适宜大小在FV1200激光共聚焦显微镜在观察融合蛋白的亚细胞位置。改造后的pDOE-20载体如图所示。图4pDOE-20载体示意图（李格2019）A：去掉mTurquoise2；B：去掉mVenusFig.4pDOE-20vectordiagram(GeLi2019)A:RemovemTurquoise2;B:RemovemVenus2.1.11BnaPAP2.A7三个转录本酵母双杂实验在拟南芥中，PAP2蛋白分别与bHLH家族蛋白和WD40蛋白结合形成MBW复合体，参与花青素的转录调控，而甘蓝型油菜BnaPAP2.A7蛋白的互作蛋白还未见报道。为了研究BnaPAP2.A7三个转录本与AtTT8蛋白是否存在互作，设计了相应引物（附表1）。首先利用AT-TT8-F2/AT-TT8-R2引物从拟南芥叶片cDNA中克隆AtTT8，经TA克隆测序后提质粒备用。分别用PAP2-EcoRI-F/PAP2-BamHI-R引物
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用菘蓝创建抗病毒油菜及新的雄性不育/恢复系统[J]. 康雷,李鹏飞,王爱凡,李再云. 中国油料作物学报. 2018(05)
[2]我国油菜多功能开发利用现状及发展对策[J]. 张哲,殷艳,刘芳,王积军,傅廷栋. 中国油料作物学报. 2018(05)
[3]以新需求为导向的油菜产业发展战略[J]. 王汉中. 中国油料作物学报. 2018(05)
[4]蓝莓的营养价值及保健功能研究进展[J]. 李殿鑫,戴远威,陈伟,刘华. 农产品加工. 2018(04)
[5]我国甘蓝型油菜远缘杂交和种质创新研究进展[J]. 王爱凡,康雷,李鹏飞,李再云. 中国油料作物学报. 2016(05)
[6]我国油菜生产区域布局演变和成因分析[J]. 殷艳,廖星,余波,王汉中. 中国油料作物学报. 2010(01)
博士论文
[1]甘蓝型油菜角果长和粒重主效QTL qSLWA9的克隆与功能分析[D]. 石柳柳.华中农业大学 2019
[2]甘蓝型油菜外源渗入系株型相关性状的遗传分析[D]. 沈钰森.华中农业大学 2018
[3]甘蓝型油菜外源渗入系构建的DH群体角果相关性状的QTL检测[D]. 杨易.华中农业大学 2017
[4]甘蓝型油菜中基因表达的剂量效应及甘蓝—黑芥附加系的创建[D]. 谭晨.华中农业大学 2017
[5]甘蓝型油菜抗根肿病资源创新与PbBa8.1位点遗传转育[D]. 战宗祥.华中农业大学 2017
[6]天然异源四倍体甘蓝型油菜中亚基因组的分离及互作[D]. 朱斌.华中农业大学 2016
[7]甘蓝型油菜导入系构建、重要农艺性状QTL分析和白花基因克隆[D]. 张豹.华中农业大学 2015
[8]甘蓝型油菜—诸葛菜附加系中雌不育和花色的形态学及转录组研究[D]. 付文芹.华中农业大学 2014
[9]全套甘蓝型油菜—菘蓝单体异附加系及新型CMS的创建[D]. 康雷.华中农业大学 2014
[10]气候变化和管理措施对澳大利亚和中国油菜生产的影响[D]. 王莎.西北农林科技大学 2014
硕士论文
[1]萝卜—芥蓝杂种F1代创制及其诱发的表观遗传变异[D]. 魏丽华.华中农业大学 2009
本文编号：3411555
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
花青素代谢通路基因转录调控模式（Xuetal2014）
油菜及其近缘种不同组织花青素累积的分子机制研究11图3通过活性WBM复合物与无活性或抑制性WBM复合物之间的定量竞争调节拟南芥细胞中的花色素苷产生（Shi&Xie2014）Fig.3RegulationofanthocyaninproductioninArabidopsiscellsbyquantitativecompetitionbetweenactiveWBMcomplexesandinactiveorrepressiveWBMcomplexes(Shi&Xie2014)1.3.4芸薹属花青素代谢相关基因研究进展芸薹属植物中包含重要的油料作物甘蓝型油菜、芥菜型油菜及蔬菜白菜、甘蓝等。芸薹属二倍体白菜、甘蓝均发现有较多的变异类型，包括绿叶和紫叶的变异。在白菜中，洪山菜薹、紫白菜等均因富含花青素而表现为紫红色或紫色。在甘蓝中，也有紫包菜、紫色花椰菜等富含花青素的变异类型。同时，芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥中也存在紫色叶片的变异类型。在白菜中，研究者利用洪山菜薹（也称紫菜薹）和紫叶小白菜为研究对象，开展了一些研究。白菜中花青素相关基因定位最早由Burdzinski和Wendell（2007）报道了位于R9block的基因anl。随后，Hayashi等（2010）利用DH系紫叶材料（Iyo-hikabu）和绿叶材料（Y54）定位了另外一个花青素基因位点Anp，位于R9block。Zhou等（2013）利用红白菜Tsuda为研究材料，证明CHS基因是合成类黄酮和花青素的关键基因。Ahmed等（2015）以红叶白菜（Palgangbaechu）、部分红色白菜（8053）和绿白菜（Seoulbaechu）为研究对象，利用冷害和冻害胁迫处理，鉴定到LDOX基因在冷害和冻害处理下与TT8及MYB2存在互作，调控花青素的合成。Guo等（2015）利用紫菜薹和绿色菜薹为研究材料，进行了花青素切片观察和QTL分析，使用161个InDel标记构建了200个F2株系的遗传连锁图谱，结合F2表型数据，在A09染色体上鉴定了一个能解释56.7%表型变异的主效QTL，这一位点包
华中农业大学2020届博士研究生学位（毕业）论文22PAP2的CDS序列通过BamHI-SmaI限制性内切酶位点和改造的pDOE-20相连（图4B）作为BnaPAP2.A7蛋白亚细胞定位的对照。将构好的载体热击转化大肠杆菌DH10B，挑选单克隆进行菌落PCR检测，检测带型准确的单克隆送天一辉远公司测序，测序序列准确的单克隆菌液提取质粒后电击转化农杆菌载体GV3101，挑选单克隆用于菌液PCR检测，检测带型准确的农秆载体用于后续侵染实验。将含有融合表达蛋白的农杆菌接种到三抗LB培养基（含Kan、Gen、Rif抗生素）28℃培养16h左右，收集菌体用悬浮液（10mMMES-KOH，10mMMgCl2，150mMAcetosyringone，pH=5.6）悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.4，然后将调整好的菌液注射到4-6周的烟草幼苗叶片内。四天后，取注射过农杆菌的烟草叶片用剪刀剪成适宜大小在FV1200激光共聚焦显微镜在观察融合蛋白的亚细胞位置。改造后的pDOE-20载体如图所示。图4pDOE-20载体示意图（李格2019）A：去掉mTurquoise2；B：去掉mVenusFig.4pDOE-20vectordiagram(GeLi2019)A:RemovemTurquoise2;B:RemovemVenus2.1.11BnaPAP2.A7三个转录本酵母双杂实验在拟南芥中，PAP2蛋白分别与bHLH家族蛋白和WD40蛋白结合形成MBW复合体，参与花青素的转录调控，而甘蓝型油菜BnaPAP2.A7蛋白的互作蛋白还未见报道。为了研究BnaPAP2.A7三个转录本与AtTT8蛋白是否存在互作，设计了相应引物（附表1）。首先利用AT-TT8-F2/AT-TT8-R2引物从拟南芥叶片cDNA中克隆AtTT8，经TA克隆测序后提质粒备用。分别用PAP2-EcoRI-F/PAP2-BamHI-R引物
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用菘蓝创建抗病毒油菜及新的雄性不育/恢复系统[J]. 康雷,李鹏飞,王爱凡,李再云. 中国油料作物学报. 2018(05)
[2]我国油菜多功能开发利用现状及发展对策[J]. 张哲,殷艳,刘芳,王积军,傅廷栋. 中国油料作物学报. 2018(05)
[3]以新需求为导向的油菜产业发展战略[J]. 王汉中. 中国油料作物学报. 2018(05)
[4]蓝莓的营养价值及保健功能研究进展[J]. 李殿鑫,戴远威,陈伟,刘华. 农产品加工. 2018(04)
[5]我国甘蓝型油菜远缘杂交和种质创新研究进展[J]. 王爱凡,康雷,李鹏飞,李再云. 中国油料作物学报. 2016(05)
[6]我国油菜生产区域布局演变和成因分析[J]. 殷艳,廖星,余波,王汉中. 中国油料作物学报. 2010(01)
博士论文
[1]甘蓝型油菜角果长和粒重主效QTL qSLWA9的克隆与功能分析[D]. 石柳柳.华中农业大学 2019
[2]甘蓝型油菜外源渗入系株型相关性状的遗传分析[D]. 沈钰森.华中农业大学 2018
[3]甘蓝型油菜外源渗入系构建的DH群体角果相关性状的QTL检测[D]. 杨易.华中农业大学 2017
[4]甘蓝型油菜中基因表达的剂量效应及甘蓝—黑芥附加系的创建[D]. 谭晨.华中农业大学 2017
[5]甘蓝型油菜抗根肿病资源创新与PbBa8.1位点遗传转育[D]. 战宗祥.华中农业大学 2017
[6]天然异源四倍体甘蓝型油菜中亚基因组的分离及互作[D]. 朱斌.华中农业大学 2016
[7]甘蓝型油菜导入系构建、重要农艺性状QTL分析和白花基因克隆[D]. 张豹.华中农业大学 2015
[8]甘蓝型油菜—诸葛菜附加系中雌不育和花色的形态学及转录组研究[D]. 付文芹.华中农业大学 2014
[9]全套甘蓝型油菜—菘蓝单体异附加系及新型CMS的创建[D]. 康雷.华中农业大学 2014
[10]气候变化和管理措施对澳大利亚和中国油菜生产的影响[D]. 王莎.西北农林科技大学 2014
硕士论文
[1]萝卜—芥蓝杂种F1代创制及其诱发的表观遗传变异[D]. 魏丽华.华中农业大学 2009
本文编号：3411555
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