利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得水稻GRAS家族转录因子G540突变体
发布时间：2021-10-07 00:31
GRAS转录因子是植物特有转录因子,一般由保守的GRAS结构域组成,与光信号转导、赤霉素信号转导、植物生长发育及植物逆境胁迫响应密切相关。水稻GRAS转录因子G540中含有2个RPT1结构域和2个GRAS结构域,系统进化分析和表达模式分析发现,G540属于GRAS转录因子家族中的HAM亚家族,在水稻穗早期发育阶段特异表达,推断G540可能参与穗的早期分化或形态建成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对G540进行定点编辑,构建G540基因敲除载体并利用农杆菌介导转化水稻粳稻品种‘9522’,鉴定并获得遗传转化植株。对转化植株的靶序列进行分析发现,9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C碱基,9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之间插入了一个A碱基,9522G540-2在G540的双等位基因上出现了不同的突变,一条链在靶序列上缺失了第4位C碱基,另一条链在靶序列上缺失8个碱基。对G540突变后的氨基酸序列分析发现,9522G540-1、9522G540-2和9522G540-4的RPT1和GRAS结构域完全缺...
【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(14)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
水稻GRAS家族系统进化分析
本研究利用CRISPR/Cas9技术共获得了10株转基因植株，其中9株在G540的靶位点处出现了突变，突变率达到90%。上述9株突变体中共存在3种不同突变类型(图4)，其中9522G540-1突变类型的共有5株，占55.6%;9522G540-4突变类型的共有3株，占33.3%;9522G540-2突变类型的共有1株，占11.1%。进一步对G540突变类型分析发现(图4)，未突变的G540编码一个含有462个氨基酸的转录因子，其中两个RPT1结构域分别为第61位至第73位氨基酸基序和第117位至第129位氨基酸基序，GRAS结构域为第173位至第460位氨基酸序列；9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C碱基，导致移码突变并提前终止翻译，仅编码出一个含有63个氨基酸的残缺序列；9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之间插入了一个A碱基，导致移码突变并提前终止翻译，仅编码出一个含有18个氨基酸的残缺序列；9522G540-2在G540的双等位基因上出现了不同的突变，一条链在靶序列上缺失了第4位C碱基，导致移码突变并提前终止翻译，仅编码出一个含有63个氨基酸的残缺序列，而另一条链在靶序列上缺失8个碱基，导致移码突变并提前终止翻译，仅编码出一个含有15个氨基酸的残缺序列。突变位点、测序峰图和氨基酸序列(图4)。综上分析可知，突变体9522G540-1、9522G540-2和9522G540-4不能正常翻译G540蛋白序列，核心结构域RPT1和GRAS完全缺失，导致G540功能缺陷，即成功获得G540功能缺陷型突变体。2 讨论
水稻GRAS转录因子家族能够参与光信号转导、赤霉素信号转导、植物生长发育及植物逆境胁迫响应等途径，而影响水稻穗发育的GRAS转录因子却未见报道。本研究前期利用水稻穗发育的转录组分析获得一个GRAS类型的转录因子G540，隶属于HAM亚家族。在拟南芥中，HAM家族成员与茎尖分生组织和叶腋分生组织的发育进程息息相关(Li et al.,2003)。时空表达模式分析发现G540在水稻穗发育早期特异表达，表明G540可能参与茎顶端分生组织转化幼穗发育、穗分化及形态建成等进程。CRISPR/Cas9系统为反向遗传学研究及作物遗传育种提供了高效便捷的研究方法及工具。本研究利用CRISPR/Cas9技术，成功构建并转化了G540的基因编辑载体，鉴定到3种以‘9522’为背景材料的G540功能缺陷型突变体，突变体均为靶序列突变导致移码，提前终止翻译。下一步通过显微观察突变体的幼穗分化及穗的发育，揭示G540在水稻幼穗发育过程中的生物学功能；进一步挖掘转录因子G540互作蛋白和下游基因，解析G540在水稻幼穗发育过程中的分子机制及调控网络。本研究获得的G540功能缺失突变体为深入研究G540在幼穗发育过程中的生物学功能和分子机制提供遗传材料。
【参考文献】：
期刊论文
[1]水稻穗发育基因OsD1功能的初步分析[J]. 邓尧,李懿星,王天抗,邱牡丹,宋书峰,赵学琳,李莉,刘建丰. 杂交水稻. 2018(05)
[2]水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建[J]. 邱牡丹,李莉,李懿星,王建龙. 基因组学与应用生物学. 2018(10)
[3]植物转录因子GRAS蛋白的研究进展[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳,李景富. 基因组学与应用生物学. 2016(09)
[4]植物GRAS蛋白研究的新进展[J]. 张文霞,刁志娟,吴为人. 分子植物育种. 2016(05)
本文编号：3421033
【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(14)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
水稻GRAS家族系统进化分析
本研究利用CRISPR/Cas9技术共获得了10株转基因植株，其中9株在G540的靶位点处出现了突变，突变率达到90%。上述9株突变体中共存在3种不同突变类型(图4)，其中9522G540-1突变类型的共有5株，占55.6%;9522G540-4突变类型的共有3株，占33.3%;9522G540-2突变类型的共有1株，占11.1%。进一步对G540突变类型分析发现(图4)，未突变的G540编码一个含有462个氨基酸的转录因子，其中两个RPT1结构域分别为第61位至第73位氨基酸基序和第117位至第129位氨基酸基序，GRAS结构域为第173位至第460位氨基酸序列；9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C碱基，导致移码突变并提前终止翻译，仅编码出一个含有63个氨基酸的残缺序列；9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之间插入了一个A碱基，导致移码突变并提前终止翻译，仅编码出一个含有18个氨基酸的残缺序列；9522G540-2在G540的双等位基因上出现了不同的突变，一条链在靶序列上缺失了第4位C碱基，导致移码突变并提前终止翻译，仅编码出一个含有63个氨基酸的残缺序列，而另一条链在靶序列上缺失8个碱基，导致移码突变并提前终止翻译，仅编码出一个含有15个氨基酸的残缺序列。突变位点、测序峰图和氨基酸序列(图4)。综上分析可知，突变体9522G540-1、9522G540-2和9522G540-4不能正常翻译G540蛋白序列，核心结构域RPT1和GRAS完全缺失，导致G540功能缺陷，即成功获得G540功能缺陷型突变体。2 讨论
水稻GRAS转录因子家族能够参与光信号转导、赤霉素信号转导、植物生长发育及植物逆境胁迫响应等途径，而影响水稻穗发育的GRAS转录因子却未见报道。本研究前期利用水稻穗发育的转录组分析获得一个GRAS类型的转录因子G540，隶属于HAM亚家族。在拟南芥中，HAM家族成员与茎尖分生组织和叶腋分生组织的发育进程息息相关(Li et al.,2003)。时空表达模式分析发现G540在水稻穗发育早期特异表达，表明G540可能参与茎顶端分生组织转化幼穗发育、穗分化及形态建成等进程。CRISPR/Cas9系统为反向遗传学研究及作物遗传育种提供了高效便捷的研究方法及工具。本研究利用CRISPR/Cas9技术，成功构建并转化了G540的基因编辑载体，鉴定到3种以‘9522’为背景材料的G540功能缺陷型突变体，突变体均为靶序列突变导致移码，提前终止翻译。下一步通过显微观察突变体的幼穗分化及穗的发育，揭示G540在水稻幼穗发育过程中的生物学功能；进一步挖掘转录因子G540互作蛋白和下游基因，解析G540在水稻幼穗发育过程中的分子机制及调控网络。本研究获得的G540功能缺失突变体为深入研究G540在幼穗发育过程中的生物学功能和分子机制提供遗传材料。
【参考文献】：
期刊论文
[1]水稻穗发育基因OsD1功能的初步分析[J]. 邓尧,李懿星,王天抗,邱牡丹,宋书峰,赵学琳,李莉,刘建丰. 杂交水稻. 2018(05)
[2]水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建[J]. 邱牡丹,李莉,李懿星,王建龙. 基因组学与应用生物学. 2018(10)
[3]植物转录因子GRAS蛋白的研究进展[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳,李景富. 基因组学与应用生物学. 2016(09)
[4]植物GRAS蛋白研究的新进展[J]. 张文霞,刁志娟,吴为人. 分子植物育种. 2016(05)
本文编号：3421033
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