与SMV-P3互作的GmEF1A和GmVATP的大豆遗传转化及转基因后代抗SMV鉴定
发布时间：2021-10-12 11:27
大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的一种病毒,能侵染大豆并引起花叶、皱缩和坏死等症状,在全球大豆产区造成了严重的减产和品质下降。以传统育种方式培育抗SMV新品种是当前最普遍的防治策略,但这种方法培育出的品系对SMV不同株系的抗性存在差异。同时病毒的遗传物质简单,往往易变异分化出不同的株系。因此传统育种方法在病毒防治方面有很大的局限性。当下发展迅速的转基因技术和RNA干扰技术能打破这一屏障,培育出对大豆花叶病毒具有广谱抗性的新品种。在酵母双杂实验（Yeast Two Hybrid,Y2H）中发现大豆翻译延伸因子1A（Soybean Translation Elongation Factor,GmEF1 A）和大豆液泡三磷酸酶（Soybean Vacuolar-ATPase,GmVATP）与SMV-P3有很强的互作关系,也与病毒复制相关。随后的病毒诱导的基因沉默（Virus Induced Gene Silencing,VIGS）实验发现,GmEF1A和Gm VA TP功能的阻断或干扰能抑制SMV对大豆的侵染。但未见利用农...
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１?ＳＭＶ基因组结构和蛋白切割位点（Ｇａｇａｒｉｎｏｖａ等，２００８）??
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【参考文献】：
期刊论文
[1]农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化[J]. 翟锐,高乐,丁雪妮,廖文林,郑明洁,陆智文,智海剑. 大豆科学. 2015(05)
[2]国外转基因大豆种植与育种研究进展[J]. 崔宁波,宋秀娟. 东北农业大学学报. 2015(08)
[3]病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究进展[J]. 宋震,李中安,周常勇. 园艺学报. 2014(09)
[4]大豆花叶病毒CP基因RNAi载体的构建及大豆遗传转化[J]. 高乐,翟锐,丁雪妮,李凯,廖文林,智海剑. 植物保护学报. 2014(04)
[5]鲁豫皖大豆产区大豆花叶病毒株系的鉴定及动态变化分析[J]. 王大刚,田震,李凯,李华伟,黄志平,胡国玉,张磊,智海剑. 大豆科学. 2013(06)
[6]农杆菌介导的RNAiCP基因在大豆中的转化[J]. 章洁琼,李红艳,胡小南,单志慧,唐桂香. 作物学报. 2013(09)
[7]大豆病虫害发展态势分析与思考[J]. 许艳丽. 大豆科技. 2013(01)
[8]大豆的营养价值及功效[J]. 张海生. 大豆科技. 2012(01)
[9]大豆抗花叶病毒病研究进展[J]. 董志敏,刘佳,衣志刚. 安徽农业科学. 2009(35)
[10]黄淮地区大豆花叶病毒株系的鉴定与分布[J]. 战勇,智海剑,喻德跃,盖钧镒. 中国农业科学. 2006(10)
博士论文
[1]大豆花叶病毒P3蛋白的寄主互作因子筛选、鉴定及功能验证[D]. 栾鹤翔.南京农业大学 2015
本文编号：3432489
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１?ＳＭＶ基因组结构和蛋白切割位点（Ｇａｇａｒｉｎｏｖａ等，２００８）??
益。??２．１农杆菌介导法??农杆菌是革兰氏阴性菌，大量分布于土壤中。根据其侵染症状和质粒类型可分为??根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌含有Ｔｉ质粒，侵染植株会产生冠瘿瘤（Ｃｒｏｗｎ??ｇａｌｌ）；发根农杆菌含有Ｒｉ质粒，能诱导植物产生发状根（Ｚａｅｎｅｎ等，１９７４；?Ｃｈｉｌｔｏｎ??等，１９７７，１９８２）。Ｔｉ质粒和Ｒｉ质粒上都含有一段侵染植物所必须的转移ＤＮＡ??（Ｔｒａｎｓｆｅｒ－ＤＮＡ，?Ｔ－ＤＮＡ），当农杆菌侵染寄主后，能将Ｔ－ＤＮＡ插入到目标植物的??基因组中（图１．２）。因此，农杆菌是自然界中一种天然的转基因媒介。农杆菌该特??性被发现后，它的Ｔ－ＤＮＡ经人工修饰后转化效率得到提升，加之组培技术的进步，??现在农杆菌介导的（ｄｇｒａｏｋ／ｃ／ｅｎ＇ｗｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）转基因技术成为基因工程中应用最普??遍的一项生物技术。??．????（Ｉ?＾??翁?乂?＇?／?；??Ｓ?＾?＼：，?：?／ｉ?＾??？?＾?ｗｒ?＊??，Ｔ．?一；?—?，??％?＇?／??图１．２农杆菌介；的基因转化棂型（Ｔｚｆｉｒａ和Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，?２００６）??Ｆｉｇ．?１．２?Ａ?ｍｏｄｅｌ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｉａｎｓｆｏｒｍａｌｉｏｎ??（Ｔｚｆｉｒａａｎｄ?ａｎｄＣｉｔｏｖｓｋｙ?２００６）??５??
??大豆翻译延伸因子１Ａ和大豆液泡三磷酸酶的大豆遗传转化及抗ＳＭＶ病鉴定???对ＰＣＲ产物进行２％的琼脂糖凝胶电泳检测，随后用ＡＸＹＧＥＮ公司的ＤＮＡ凝??胶回收试剂盒回收条带大小正确的产物（步骤见附录３）。所得干扰片段送交上海华??大公司进行测序，在ＮＣＢＩ对测序结果进行ＢＬＡＳＴ比对。??１．２．３?Ｇａｔｅｗａｙ技术快速构建ＲＮＡｉ载体??Ｇａｔｅｗａｙ体系包括ＢＰ反应和ＬＲ反应两部分，通过ＢＰ反应构建中间载体，再通??过ＬＲ反应构建表达载体（图２．１）。体系中的入门载体ｐＤＯＮＲ２２１和表达载体??ｐＢ７ＧＷＩＷＧ２?（?ＩＩ）都保存在大肠杆菌ＤＨ５ａ菌液中。实验前先从扩繁后的菌液中提??取质粒，－２０°Ｃ中保存备用。??ａｔｔＢ?ｍＰｆ??ａｆｆＳ－ｆｂｎｔｅｄ?ＰＣＲ?（?＾ｎ〇ｆ?ｊ??（?ｅｎｔｆｙ?）?ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ??ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｒ?ａｔ（３?＼?ｖｅｃｔｏｒ?／?＼?ｃｌｏｎｅ?Ｊ??ｅｘｐｒｅｓｓａｃｓｎ?ｃｆｏｎｅ??ａｆｆｔ?ｄ?金ｉ?ｍｔＨ?ａＳｆＳＩ?Ｍ３?ａＳＢ?？ｒｔＰ?ａｉ？Ｐ??＋?ｎｗｒａＫｉｉ?ＬＳＣ，＾，?＋??ｌ?ｅｎｔｒｙ?）?ｌ?ｄｏｓＳｒｕｔｏｎ?１??？?ｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｊ?ｉ?Ｏｊｆ－ｐｒｏｄｏｅｔ?Ｊ??＼?ｃｔｏｒ？?／?Ｖ?ｖｏｄｅｒ?ｙ?Ｖ．?ｄｏｎ？?ｙ?Ｖ?／??图２．１?Ｇａｔｅｗａｙ技术的反应原理??Ｆｉｇ．?２．１?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?Ｇａｔｅｗａｙ?ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ??ＢＰ反应步骤：????在１．５?ｍＬ灭菌离心管内??配置１０卩Ｌ反应体系（表??２
【参考文献】：
期刊论文
[1]农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化[J]. 翟锐,高乐,丁雪妮,廖文林,郑明洁,陆智文,智海剑. 大豆科学. 2015(05)
[2]国外转基因大豆种植与育种研究进展[J]. 崔宁波,宋秀娟. 东北农业大学学报. 2015(08)
[3]病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究进展[J]. 宋震,李中安,周常勇. 园艺学报. 2014(09)
[4]大豆花叶病毒CP基因RNAi载体的构建及大豆遗传转化[J]. 高乐,翟锐,丁雪妮,李凯,廖文林,智海剑. 植物保护学报. 2014(04)
[5]鲁豫皖大豆产区大豆花叶病毒株系的鉴定及动态变化分析[J]. 王大刚,田震,李凯,李华伟,黄志平,胡国玉,张磊,智海剑. 大豆科学. 2013(06)
[6]农杆菌介导的RNAiCP基因在大豆中的转化[J]. 章洁琼,李红艳,胡小南,单志慧,唐桂香. 作物学报. 2013(09)
[7]大豆病虫害发展态势分析与思考[J]. 许艳丽. 大豆科技. 2013(01)
[8]大豆的营养价值及功效[J]. 张海生. 大豆科技. 2012(01)
[9]大豆抗花叶病毒病研究进展[J]. 董志敏,刘佳,衣志刚. 安徽农业科学. 2009(35)
[10]黄淮地区大豆花叶病毒株系的鉴定与分布[J]. 战勇,智海剑,喻德跃,盖钧镒. 中国农业科学. 2006(10)
博士论文
[1]大豆花叶病毒P3蛋白的寄主互作因子筛选、鉴定及功能验证[D]. 栾鹤翔.南京农业大学 2015
本文编号：3432489
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