甘薯SSR-PCR反应体系的优化及遗传多样性研究
发布时间：2021-11-28 06:31
甘薯作为中国第五大粮食作物,同时也是重要的轻工、化工、纺织、铸造和制革的原料,对国民经济有重要意义。在中国大部分地区,甘薯主要为无性繁殖,而海南岛属亚热带地区,满足甘薯开花结果条件,得天独厚的热带季风气候可为其育种和周年生产提供有力的环境条件。但实际上,目前海南地区主栽甘薯品种较少、且部分品种品质指标相对较低。在甘薯产业发展上,未充分发挥出海南（较北方地区）的地域优势。因此,大量收集甘薯种质资源,理清其遗传关系,并选育出适合海南地区栽培的多抗、高产、专用型优良甘薯品种,将大力推动海南甘薯产业的发展。本研究优化了甘薯SSR-PCR反应体系,并利用SSR分子标记技术对30份甘薯种质资源进行了遗传多样性研究,旨在为今后的甘薯选育提供一定的理论基础。本研究共得到以下结果:（1）建立了甘薯单重和多重SSR-PCR反应体系。该反应体系包括:10μL2×PCRMix、100ng模板DNA、0.4μmol/L引物,1μL甘油,总体积20μL;扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性45s、Tm+5℃～Tm-5℃ （每循环退火温度下降0.5℃, Tm选用一对引物中的较小Tm值）退火30s （退火时...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２部分甘薯基因组ＤＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．?２?Ｔｈｅ?ｇｅｎｏｔｉｃ?ＤＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｐａｒｔｉａｌ?ｓｗｅｅｔ?ｐｏｔａｔｏｅｓ??
３．２．２?Ｇ－ＰＣＲ?与?ＴＤ－ＰＣＲ?结果比较??随机选择１０份甘薯种质，对正交得出的最优组合分别进行降落退火和梯度退??火，选取更适合的退火方式。由图４可以看出，不同的退火方式，部分泳道得到的??扩增结果相同，部分则略有差异。Ｇ－ＰＣＲ方式敏感性较高，条带较多，ＴＤ－ＰＣＲ条??带则特异性相对较高，部分条带颜色较浅，对于相同材料不同退火方式产生条带有??同有异的现象则可能是退火原理不同导致。ＴＤ－ＰＣＲ从较高的温度开始退火，保证??了条带的特异性。综合考虑俩种退火方式的扩增结果及可靠性，认为ＴＤ－ＰＣＲ更适??合ＳＳＲ的扩增，条带深浅则可以下一步优化。??體???１３０??ｍ??響?Ｇ－ＰＣＲ?ｍ?ＴＤ－ＰＣＲ?響．??图４?Ｇ－ＰＣＲ与ＴＤ－ＰＣＲ的扩增结果??Ｆｉｇ．?４．Ｔｈｅ?Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｇ－ＰＣＲ?ａｎｄ?ＴＤ－ＰＣＲ??３．２．３不同ＴＤ－ＰＣＲ程序扩增结果分析??针对ＴＤ－ＰＣＲ部分条带较浅的问题，通过调节循环数目加以优化，为避免循环??数目变化导致条带特异性较低，同时对退火时间进行优化。由图５可以看出，在一??定循环数和退火时间范围内
Ｆｉｇ．?６?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｓａｍｐｌｅ?ａｍｏｕｎｔ?ｉｎ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ??３．２．５?ＴＤ－ＰＣＲ优化体系的验证??随机筛选引物Ｚ３７对优化后的ＴＤ－ＰＣＲ反应体系进行验证。由图７可以看出，??利用引物Ｚ３７进行ＴＤ－ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增时效果良好，退火３０ｓ和２０ｓ扩增条带大小和??数目大致相同，但退火时间为３０ｓ时较大片段更加清晰。在之前的优化过程中则发??现，引物ＺＹ５退火２０§更为合适，造成这种现象的原因可能是因为不同引物目的片??段大小不一，目的片段大则所需退火时间长，反之则短。因此，需要根据不同引物??的目的片段大小适当选择退火时间。??ｒ明．?…??麵?ｕ?ｎ?Ｈ?Ｓ?ｎ?１３?ｕ?Ｂ??遇火?３０３?＊＾２０ｓ??图７引物Ｚ３７的ＴＤ－ＳＳＲ扩增结果??Ｆｉｇ．?７?Ｔｈｅ?ＴＤ－ＳＳＲ?Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ?ｂｙ?ｔｈｅ?ｐｒｉｍｅｒ?Ｚ３７??３．３多重ＳＳＲ的优化??３．３．１甘薯多重ＳＳＲ－ＰＣＲ反应引物的筛选??利用前期对３０份甘薯材料的聚类和遗传多样性分析结果，筛选出遗传差异较大??的２、１６、２２、２６号甘薯材料作为多重ＰＣＲ优化材料。同时以多态性条带集中，易??于读带为基础，筛选出编号为４、７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２２、２６、２７、２８、??１８??
【参考文献】：
期刊论文
[1]三种甘薯病毒多重RT-PCR检测技术的建立[J]. 蒋素华,程喜梅,宋彩霞,许申平,梁芳,崔波. 植物保护. 2017(01)
[2]30份海南地区引种甘薯种质资源的SSR分析[J]. 南文卓,张小贝,苏一钧,祝志欣,曹清河,朱国鹏. 贵州农业科学. 2016(12)
[3]基于EST-SSR标记甘薯连锁图谱构建及淀粉性状的QTL定位[J]. 唐道彬,张凯,吕长文,谢德斌,傅体华,王季春. 中国农业科学. 2016(23)
[4]用于羊草基因分型的SNP分子标记技术研究[J]. 侯莉娟,齐晓,齐冬梅,陈双燕,刘公社. 草业学报. 2016(02)
[5]利用简化基因组技术分析甘薯种间单核苷酸多态性[J]. 石璇,王茹媛,唐君,李宗芸,罗永海. 作物学报. 2016(05)
[6]中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析[J]. 罗凯,卢会翔,吴正丹,吴雪莉,尹旺,唐道彬,王季春,张凯. 中国农业科学. 2016(03)
[7]基于SLAF-seq技术的甘薯SNP位点开发[J]. 苏文瑾,赵宁,雷剑,王连军,柴沙沙,杨新笋. 中国农业科学. 2016(01)
[8]番薯属甘薯与牵牛EST-SSR标记开发及通用性分析[J]. 兰孟焦,吴问胜,黄水金,潘皓. 分子植物育种. 2015(12)
[9]茶树DNA分子指纹图谱研究进展[J]. 黄丹娟,马建强,陈亮. 茶叶科学. 2015(06)
[10]22个甘薯品种的ISSR指纹图谱构建及遗传多样性分析[J]. 张安世,许会才,王育水. 河南农业科学. 2015(11)
博士论文
[1]基于SSR、SNP和形态学标记的甘薯种质资源遗传多样性研究[D]. 杨新笋.中国农业大学 2016
[2]甘薯SSR分子连锁图谱的构建和块根产量相关QTL的定位[D]. 李慧.中国农业大学 2014
[3]甜菜栽培品种的DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析[D]. 吴则东.中国农业科学院 2013
硕士论文
[1]基于甘薯徐781和徐薯18转录组测序的SNP标记开发[D]. 许家磊.中国农业科学院 2015
[2]苜蓿遗传图谱的构建和重要农艺性状的基因定位[D]. 刘曙娜.内蒙古大学 2012
[3]甘蔗SSR分子指纹图谱数据库构建与管理系统的开发[D]. 叶琳莉.福建农林大学 2012
[4]杨梅栽培品种的SSR标记指纹数据库和多重荧光标记鉴别技术[D]. 周剑.浙江大学 2011
[5]mcrA基因的克隆及其在分析沼气池产甲烷菌多样性中的应用研究[D]. 徐彦胜.中国农业科学院 2010
[6]49份甘薯种质资源在海南的试验评价[D]. 甘学德.海南大学 2010
[7]三种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立及甘薯脉花叶病毒（SPVMV）的分子鉴定[D]. 张业辉.河南农业大学 2009
[8]甘薯品种亲缘关系的RAPD和ISSR分子标记分析[D]. 张奕.福建农林大学 2007
本文编号：3523899
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２部分甘薯基因组ＤＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．?２?Ｔｈｅ?ｇｅｎｏｔｉｃ?ＤＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｐａｒｔｉａｌ?ｓｗｅｅｔ?ｐｏｔａｔｏｅｓ??
３．２．２?Ｇ－ＰＣＲ?与?ＴＤ－ＰＣＲ?结果比较??随机选择１０份甘薯种质，对正交得出的最优组合分别进行降落退火和梯度退??火，选取更适合的退火方式。由图４可以看出，不同的退火方式，部分泳道得到的??扩增结果相同，部分则略有差异。Ｇ－ＰＣＲ方式敏感性较高，条带较多，ＴＤ－ＰＣＲ条??带则特异性相对较高，部分条带颜色较浅，对于相同材料不同退火方式产生条带有??同有异的现象则可能是退火原理不同导致。ＴＤ－ＰＣＲ从较高的温度开始退火，保证??了条带的特异性。综合考虑俩种退火方式的扩增结果及可靠性，认为ＴＤ－ＰＣＲ更适??合ＳＳＲ的扩增，条带深浅则可以下一步优化。??體???１３０??ｍ??響?Ｇ－ＰＣＲ?ｍ?ＴＤ－ＰＣＲ?響．??图４?Ｇ－ＰＣＲ与ＴＤ－ＰＣＲ的扩增结果??Ｆｉｇ．?４．Ｔｈｅ?Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｇ－ＰＣＲ?ａｎｄ?ＴＤ－ＰＣＲ??３．２．３不同ＴＤ－ＰＣＲ程序扩增结果分析??针对ＴＤ－ＰＣＲ部分条带较浅的问题，通过调节循环数目加以优化，为避免循环??数目变化导致条带特异性较低，同时对退火时间进行优化。由图５可以看出，在一??定循环数和退火时间范围内
Ｆｉｇ．?６?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｓａｍｐｌｅ?ａｍｏｕｎｔ?ｉｎ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ??３．２．５?ＴＤ－ＰＣＲ优化体系的验证??随机筛选引物Ｚ３７对优化后的ＴＤ－ＰＣＲ反应体系进行验证。由图７可以看出，??利用引物Ｚ３７进行ＴＤ－ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增时效果良好，退火３０ｓ和２０ｓ扩增条带大小和??数目大致相同，但退火时间为３０ｓ时较大片段更加清晰。在之前的优化过程中则发??现，引物ＺＹ５退火２０§更为合适，造成这种现象的原因可能是因为不同引物目的片??段大小不一，目的片段大则所需退火时间长，反之则短。因此，需要根据不同引物??的目的片段大小适当选择退火时间。??ｒ明．?…??麵?ｕ?ｎ?Ｈ?Ｓ?ｎ?１３?ｕ?Ｂ??遇火?３０３?＊＾２０ｓ??图７引物Ｚ３７的ＴＤ－ＳＳＲ扩增结果??Ｆｉｇ．?７?Ｔｈｅ?ＴＤ－ＳＳＲ?Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ?ｂｙ?ｔｈｅ?ｐｒｉｍｅｒ?Ｚ３７??３．３多重ＳＳＲ的优化??３．３．１甘薯多重ＳＳＲ－ＰＣＲ反应引物的筛选??利用前期对３０份甘薯材料的聚类和遗传多样性分析结果，筛选出遗传差异较大??的２、１６、２２、２６号甘薯材料作为多重ＰＣＲ优化材料。同时以多态性条带集中，易??于读带为基础，筛选出编号为４、７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２２、２６、２７、２８、??１８??
【参考文献】：
期刊论文
[1]三种甘薯病毒多重RT-PCR检测技术的建立[J]. 蒋素华,程喜梅,宋彩霞,许申平,梁芳,崔波. 植物保护. 2017(01)
[2]30份海南地区引种甘薯种质资源的SSR分析[J]. 南文卓,张小贝,苏一钧,祝志欣,曹清河,朱国鹏. 贵州农业科学. 2016(12)
[3]基于EST-SSR标记甘薯连锁图谱构建及淀粉性状的QTL定位[J]. 唐道彬,张凯,吕长文,谢德斌,傅体华,王季春. 中国农业科学. 2016(23)
[4]用于羊草基因分型的SNP分子标记技术研究[J]. 侯莉娟,齐晓,齐冬梅,陈双燕,刘公社. 草业学报. 2016(02)
[5]利用简化基因组技术分析甘薯种间单核苷酸多态性[J]. 石璇,王茹媛,唐君,李宗芸,罗永海. 作物学报. 2016(05)
[6]中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析[J]. 罗凯,卢会翔,吴正丹,吴雪莉,尹旺,唐道彬,王季春,张凯. 中国农业科学. 2016(03)
[7]基于SLAF-seq技术的甘薯SNP位点开发[J]. 苏文瑾,赵宁,雷剑,王连军,柴沙沙,杨新笋. 中国农业科学. 2016(01)
[8]番薯属甘薯与牵牛EST-SSR标记开发及通用性分析[J]. 兰孟焦,吴问胜,黄水金,潘皓. 分子植物育种. 2015(12)
[9]茶树DNA分子指纹图谱研究进展[J]. 黄丹娟,马建强,陈亮. 茶叶科学. 2015(06)
[10]22个甘薯品种的ISSR指纹图谱构建及遗传多样性分析[J]. 张安世,许会才,王育水. 河南农业科学. 2015(11)
博士论文
[1]基于SSR、SNP和形态学标记的甘薯种质资源遗传多样性研究[D]. 杨新笋.中国农业大学 2016
[2]甘薯SSR分子连锁图谱的构建和块根产量相关QTL的定位[D]. 李慧.中国农业大学 2014
[3]甜菜栽培品种的DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析[D]. 吴则东.中国农业科学院 2013
硕士论文
[1]基于甘薯徐781和徐薯18转录组测序的SNP标记开发[D]. 许家磊.中国农业科学院 2015
[2]苜蓿遗传图谱的构建和重要农艺性状的基因定位[D]. 刘曙娜.内蒙古大学 2012
[3]甘蔗SSR分子指纹图谱数据库构建与管理系统的开发[D]. 叶琳莉.福建农林大学 2012
[4]杨梅栽培品种的SSR标记指纹数据库和多重荧光标记鉴别技术[D]. 周剑.浙江大学 2011
[5]mcrA基因的克隆及其在分析沼气池产甲烷菌多样性中的应用研究[D]. 徐彦胜.中国农业科学院 2010
[6]49份甘薯种质资源在海南的试验评价[D]. 甘学德.海南大学 2010
[7]三种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立及甘薯脉花叶病毒（SPVMV）的分子鉴定[D]. 张业辉.河南农业大学 2009
[8]甘薯品种亲缘关系的RAPD和ISSR分子标记分析[D]. 张奕.福建农林大学 2007
本文编号：3523899
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