小麦（Triticum aestivum L.）UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的原核表达及蛋白纯化
发布时间：2021-12-28 01:55
为了研究小麦抗赤霉病相关UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的功能,利用TaUGT6基因的编码区构建了原核表达载体pGEX-TaUGT6,转化大肠杆菌BL21 （DE3）菌株后,经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）诱导表达对培养温度、培养时间进行了探索;然后利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）检测重组蛋白,进行蛋白纯化。结果表明:Ta UGT6的编码区为1 473 bp,导入大肠杆菌的TaUGT6基因能够被诱导表达,重组蛋白在25℃经过夜诱导和37℃经6 h诱导效果较好,表达重组蛋白的表现分子量与理论分子量基本一致,利用蛋白层析系统获得了纯度较高的重组可溶性蛋白。本研究为今后通过体外酶活分析、抗体制备等方法深入研究该基因的功能提供了依据。
【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(11)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
TaUGT6基因原核表达载体的构建与鉴定
TaUGT6基因的原核表达
植物中UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,UGT)是由一个基因家族所编码，其中在小麦中发现了179个UGT基因，在拟南芥中发现有100多个UGTs(Yonekura-Sakakibara and Hanada,2011;He et al.,2018)。UGTs可能在植物的防御反应中起着重要作用，将DON进行糖基化反应以减弱其毒性被认为是小麦抗赤霉病重要的抗病生理过程(Buerstmayr et al.,2009)。研究表明植物UGT基因可以减弱DON毒性而提高对赤霉病的抗性，目前在小麦中仅有少数几个UGT基因被鉴定，并且参与赤霉病抗性的作用机制仍不清楚。本研究选择了实验室前期从‘苏麦3号’中克隆的小麦UGT新基因TaUGT6，要想了解TaUGT6在小麦抗赤霉病中的具体生化功能，可以从蛋白质水平上进行深入研究。基因的原核表达是研究蛋白质结构和功能的前提，本研究在获得目的基因完整编码区的基础上，构建了TaUGT6的原核表达载体对重组蛋白进行成功表达与纯化。大肠杆菌表达系统是原核蛋白表达系统中最常用的系统，影响大肠杆菌表达融合蛋白的因素包括大肠杆菌菌株、诱导温度、诱导剂IPTG的浓度、诱导时间等(倪志勇等,2010)。考虑到IPTG浓度对大肠杆菌生长及表达的可能影响，参考前人研究(谢纯政等,2009;杨书玲等,2013;许雨晨等,2016)，发现IPTG适宜诱导浓度多为0.5～1 mmol/L，故选1 mmol/L为理想浓度，然后对诱导温度和诱导时间进行了优化。试验表明在恒定温度下重组蛋白随诱导时间增加表达量逐渐增加，达到峰值后蛋白表达量有降低趋势，这可能是随着大肠杆菌培养时间的增加，菌液的活力有所下降，进而降低了融合蛋白的产量，最终选择最佳表达条件为1 mmol/L IPTG在37℃振荡培养6 h或者1 mmol/L IPTG在25℃振荡培养过夜。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物糖基转移酶基因的分离方法及其生物学功能研究进展[J]. 罗燕,刘小刚,周志钦. 生物技术通报. 2016(12)
[2]稻瘟病菌Dam1基因的克隆、原核表达及纯化[J]. 许雨晨,吕哲,陈保善,彭好文. 基因组学与应用生物学. 2016(09)
[3]脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性的研究进展[J]. 许伟,耿芳芳,范梦雪,胡文娟,宫佳杰,林根祥,李玉,吴金节,王希春. 生物学杂志. 2016(01)
[4]Cloning and characterization of a novel UDP-glycosyltransferase gene induced by DON from wheat[J]. MA Xin,DU Xu-ye,LIU Guo-juan,YANG Zai-dong,HOU Wen-qian,WANG Hong-wei,FENG De-shun,LI An-fei,KONG Ling-rang. Journal of Integrative Agriculture. 2015(05)
[5]小麦TaPDK基因的序列分析、原核表达及纯化[J]. 杨书玲,张龙雨,张改生,桑青,刘红占,朱启迪,张新钵,赵新亮. 核农学报. 2013(08)
[6]植物UDP-糖基转移酶生化特性和功能研究进展[J]. 姬向楠,何非,段长青,王军. 食品科学. 2013(09)
[7]中国小麦赤霉病的危害及抗性遗传改良[J]. 程顺和,张勇,别同德,高德荣,张伯桥. 江苏农业学报. 2012(05)
[8]棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达[J]. 倪志勇,李波,范玲. 核农学报. 2010(05)
[9]小麦赤霉病抗性改良研究进展[J]. 马鸿翔,陆维忠. 江苏农业学报. 2010(01)
[10]植物糖基转移酶及其在代谢工程中的应用[J]. 周文灵,陈刚,王瑛华,李玲. 生物技术. 2009(06)
博士论文
[1]小麦抗赤霉病相关基因的克隆及功能分析[D]. 马信.山东农业大学 2014
硕士论文
[1]小麦抗赤霉病相关基因TaUGT3和TaPRP转化普通小麦的研究[D]. 陈启广.南京农业大学 2013
本文编号：3553173
【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(11)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
TaUGT6基因原核表达载体的构建与鉴定
TaUGT6基因的原核表达
植物中UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,UGT)是由一个基因家族所编码，其中在小麦中发现了179个UGT基因，在拟南芥中发现有100多个UGTs(Yonekura-Sakakibara and Hanada,2011;He et al.,2018)。UGTs可能在植物的防御反应中起着重要作用，将DON进行糖基化反应以减弱其毒性被认为是小麦抗赤霉病重要的抗病生理过程(Buerstmayr et al.,2009)。研究表明植物UGT基因可以减弱DON毒性而提高对赤霉病的抗性，目前在小麦中仅有少数几个UGT基因被鉴定，并且参与赤霉病抗性的作用机制仍不清楚。本研究选择了实验室前期从‘苏麦3号’中克隆的小麦UGT新基因TaUGT6，要想了解TaUGT6在小麦抗赤霉病中的具体生化功能，可以从蛋白质水平上进行深入研究。基因的原核表达是研究蛋白质结构和功能的前提，本研究在获得目的基因完整编码区的基础上，构建了TaUGT6的原核表达载体对重组蛋白进行成功表达与纯化。大肠杆菌表达系统是原核蛋白表达系统中最常用的系统，影响大肠杆菌表达融合蛋白的因素包括大肠杆菌菌株、诱导温度、诱导剂IPTG的浓度、诱导时间等(倪志勇等,2010)。考虑到IPTG浓度对大肠杆菌生长及表达的可能影响，参考前人研究(谢纯政等,2009;杨书玲等,2013;许雨晨等,2016)，发现IPTG适宜诱导浓度多为0.5～1 mmol/L，故选1 mmol/L为理想浓度，然后对诱导温度和诱导时间进行了优化。试验表明在恒定温度下重组蛋白随诱导时间增加表达量逐渐增加，达到峰值后蛋白表达量有降低趋势，这可能是随着大肠杆菌培养时间的增加，菌液的活力有所下降，进而降低了融合蛋白的产量，最终选择最佳表达条件为1 mmol/L IPTG在37℃振荡培养6 h或者1 mmol/L IPTG在25℃振荡培养过夜。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物糖基转移酶基因的分离方法及其生物学功能研究进展[J]. 罗燕,刘小刚,周志钦. 生物技术通报. 2016(12)
[2]稻瘟病菌Dam1基因的克隆、原核表达及纯化[J]. 许雨晨,吕哲,陈保善,彭好文. 基因组学与应用生物学. 2016(09)
[3]脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性的研究进展[J]. 许伟,耿芳芳,范梦雪,胡文娟,宫佳杰,林根祥,李玉,吴金节,王希春. 生物学杂志. 2016(01)
[4]Cloning and characterization of a novel UDP-glycosyltransferase gene induced by DON from wheat[J]. MA Xin,DU Xu-ye,LIU Guo-juan,YANG Zai-dong,HOU Wen-qian,WANG Hong-wei,FENG De-shun,LI An-fei,KONG Ling-rang. Journal of Integrative Agriculture. 2015(05)
[5]小麦TaPDK基因的序列分析、原核表达及纯化[J]. 杨书玲,张龙雨,张改生,桑青,刘红占,朱启迪,张新钵,赵新亮. 核农学报. 2013(08)
[6]植物UDP-糖基转移酶生化特性和功能研究进展[J]. 姬向楠,何非,段长青,王军. 食品科学. 2013(09)
[7]中国小麦赤霉病的危害及抗性遗传改良[J]. 程顺和,张勇,别同德,高德荣,张伯桥. 江苏农业学报. 2012(05)
[8]棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达[J]. 倪志勇,李波,范玲. 核农学报. 2010(05)
[9]小麦赤霉病抗性改良研究进展[J]. 马鸿翔,陆维忠. 江苏农业学报. 2010(01)
[10]植物糖基转移酶及其在代谢工程中的应用[J]. 周文灵,陈刚,王瑛华,李玲. 生物技术. 2009(06)
博士论文
[1]小麦抗赤霉病相关基因的克隆及功能分析[D]. 马信.山东农业大学 2014
硕士论文
[1]小麦抗赤霉病相关基因TaUGT3和TaPRP转化普通小麦的研究[D]. 陈启广.南京农业大学 2013
本文编号：3553173
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