转基因玉米中外源基因整合位点分析及籽粒败育的初步研究
发布时间：2022-01-09 01:33
玉米（Zea mays L.）作为我国重要的粮食作物之一,在我国的农业和工业生产中起着重要作用。玉米螟等害虫严重危害玉米生产,每年导致约10%的玉米产量损失。抗虫转基因玉米的广泛应用可以有效防治玉米虫害,降低玉米产量损失,并减少农药使用量。研发有应用价值的转基因玉米事件,需要明确外源基因在受体基因组中的整合位点,而且外源基因的整合不能对玉米生产性状产生不利影响。本研究所用的抗虫转基因玉米IE034由本实验室创制,前期研究表明该转化事件的外源基因有一个拷贝,并且室内和田间均高抗玉米螟。但是,在研究过程中发现此转基因玉米事件出现籽粒败育的现象。本文首先运用TAIL-PCR分离抗虫转基因玉米IE034的侧翼序列,通过构建Fosmid基因组文库和遗传定位的方法对外源基因的整合位点进行了研究,并对该转基因玉米出现的籽粒败育表型进行了分析。主要研究结果如下:1、通过TAIL-PCR分离出IE034中外源基因插入位置上游旁侧序列,发现外源基因插入到了玉米基因组的重复序列区,并且外源基因在插入玉米基因组中的过程中进行了复杂的整合,部分骨架载体整合到玉米基因组中。2、提取转基因玉米的基因组DNA,构建F...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
996年～2016年全球转基因作物种植面积(James,2016)
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言序列 (Liu et al, 1995a)。TAIL-PCR 是利用几个嵌套的已知序列的特异性引物依次与退火温度较低的简并引物 (Arbitrary Degenerate Primer，AD Primer) 组合。特异性的引物的退火温度较高，一般在 60℃左右；简并引物的退火温度较低，在 45℃左右。然后依据引物的差异设计不对称的温度循环，再经过巢式反应特异性的引物优先进行扩增，得到特异性的扩增产物。TAIL-PCR 反应步骤如图 1.2 所示：第一次 PCR 反应包括 5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、10 次较低特异性的反应和 12 次热不对称的的超级循环。然后将第一次反应的产物作为模板以特异引物 SP2 和同一简并引物进行热不对称超级循环，使特异性产物被选择性的扩增。第三次反应是将第二次反应产物作为模板，以 SP3 和同一引物 AD 作为引物进行普通的扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分离出已知序列邻近的目标序列。
学院硕士学位论文 进行了改进，改进后的扩增成功率高于 90%，大部分情况下获得的IL-PCR 还被应用于分离 T-DNA 插入构建的突变体库的侧翼序列。R分离T-DNA插入突变体的侧翼序列鉴定出潜在参与纤维素酶和半 年 Fujimoto 等通过 TAIL-PCR 的方法对 T-DNA 进行定位来研究染向 PCR 技术man 等 (1988) 提出依据常规的聚合酶链式反应 (PCR) 技术，通过列的方法。其原理是用已知序列选择合适的限制性内切酶消化转化进行自身环化后作为模板，在已知序列两端设计特异性引物，经过列 (图 1.3)。反向 PCR 技术成功克隆出侧翼序列后 (Triglia et al.,19
【参考文献】：
期刊论文
[1]棉花单核苷酸多态性标记研究进展[J]. 王振玉,李威,周晓箭,裴小雨,刘艳改,周克海,张文生,孟清芹,王海风,葛勇,李莹,刘俊芳,马雄风,杨代刚. 棉花学报. 2016(04)
[2]Fosmid library construction and screening for the maize mutant gene Vestigial glume 1[J]. Chaoxian Liu,Xiaoli Liu,Lei Lei,Haiying Guan,Yilin Cai. The Crop Journal. 2016(01)
[3]玉米基因组Fosmid文库构建及类受体激酶基因（Psy1和Psy2）筛选[J]. 吴晓军,徐丽,王守才. 农业生物技术学报. 2014(10)
[4]转基因水稻EB7001S事件特异性检测方法的建立[J]. 魏岁军,邓力华,肖国樱. 农业生物技术学报. 2014(05)
[5]植物转基因技术研究进展[J]. 骆翔,刘志颐,章树民,申硕,王德福,王劲松. 中国农学通报. 2014(15)
[6]一个玉米旱敏感突变体的遗传分析与基因定位[J]. 牟颖熙,刘艳,王国英,郑军. 植物遗传资源学报. 2014(03)
[7]Panhandle PCR strategy to amplify the upstream unknown sequence of the Pr1 gene of pythium guiyangense[J]. DUAN Siliang,SU Xiaoqing,YU Sheng. Journal of Medical Colleges of PLA. 2013(05)
[8]图位克隆技术在玉米基因分离中的应用[J]. 吕洪坤,郑军. 分子植物育种. 2013(03)
[9]转基因抗虫玉米环境安全性及我国应用前景[J]. 李宁,何康来,崔蕾,王振营. 植物保护. 2011(06)
[10]扩增T-DNA插入位点侧翼序列的方法及其应用进展[J]. 祁洋,李燕,王永智,尉亚辉. 安徽农业科学. 2009(17)
本文编号：3577676
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
996年～2016年全球转基因作物种植面积(James,2016)
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言序列 (Liu et al, 1995a)。TAIL-PCR 是利用几个嵌套的已知序列的特异性引物依次与退火温度较低的简并引物 (Arbitrary Degenerate Primer，AD Primer) 组合。特异性的引物的退火温度较高，一般在 60℃左右；简并引物的退火温度较低，在 45℃左右。然后依据引物的差异设计不对称的温度循环，再经过巢式反应特异性的引物优先进行扩增，得到特异性的扩增产物。TAIL-PCR 反应步骤如图 1.2 所示：第一次 PCR 反应包括 5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、10 次较低特异性的反应和 12 次热不对称的的超级循环。然后将第一次反应的产物作为模板以特异引物 SP2 和同一简并引物进行热不对称超级循环，使特异性产物被选择性的扩增。第三次反应是将第二次反应产物作为模板，以 SP3 和同一引物 AD 作为引物进行普通的扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分离出已知序列邻近的目标序列。
学院硕士学位论文 进行了改进，改进后的扩增成功率高于 90%，大部分情况下获得的IL-PCR 还被应用于分离 T-DNA 插入构建的突变体库的侧翼序列。R分离T-DNA插入突变体的侧翼序列鉴定出潜在参与纤维素酶和半 年 Fujimoto 等通过 TAIL-PCR 的方法对 T-DNA 进行定位来研究染向 PCR 技术man 等 (1988) 提出依据常规的聚合酶链式反应 (PCR) 技术，通过列的方法。其原理是用已知序列选择合适的限制性内切酶消化转化进行自身环化后作为模板，在已知序列两端设计特异性引物，经过列 (图 1.3)。反向 PCR 技术成功克隆出侧翼序列后 (Triglia et al.,19
【参考文献】：
期刊论文
[1]棉花单核苷酸多态性标记研究进展[J]. 王振玉,李威,周晓箭,裴小雨,刘艳改,周克海,张文生,孟清芹,王海风,葛勇,李莹,刘俊芳,马雄风,杨代刚. 棉花学报. 2016(04)
[2]Fosmid library construction and screening for the maize mutant gene Vestigial glume 1[J]. Chaoxian Liu,Xiaoli Liu,Lei Lei,Haiying Guan,Yilin Cai. The Crop Journal. 2016(01)
[3]玉米基因组Fosmid文库构建及类受体激酶基因（Psy1和Psy2）筛选[J]. 吴晓军,徐丽,王守才. 农业生物技术学报. 2014(10)
[4]转基因水稻EB7001S事件特异性检测方法的建立[J]. 魏岁军,邓力华,肖国樱. 农业生物技术学报. 2014(05)
[5]植物转基因技术研究进展[J]. 骆翔,刘志颐,章树民,申硕,王德福,王劲松. 中国农学通报. 2014(15)
[6]一个玉米旱敏感突变体的遗传分析与基因定位[J]. 牟颖熙,刘艳,王国英,郑军. 植物遗传资源学报. 2014(03)
[7]Panhandle PCR strategy to amplify the upstream unknown sequence of the Pr1 gene of pythium guiyangense[J]. DUAN Siliang,SU Xiaoqing,YU Sheng. Journal of Medical Colleges of PLA. 2013(05)
[8]图位克隆技术在玉米基因分离中的应用[J]. 吕洪坤,郑军. 分子植物育种. 2013(03)
[9]转基因抗虫玉米环境安全性及我国应用前景[J]. 李宁,何康来,崔蕾,王振营. 植物保护. 2011(06)
[10]扩增T-DNA插入位点侧翼序列的方法及其应用进展[J]. 祁洋,李燕,王永智,尉亚辉. 安徽农业科学. 2009(17)
本文编号：3577676
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