CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因及靶向突变检测方法的研究
发布时间：2022-01-14 01:51
香稻因其宜人的香味而受到全世界的青睐。传统的育种方式在一定范围内能够提高水稻产量和米质,但是效果不够显著,且工作量大,工作周期长。CRISPR/Cas编辑技术的发现和应用为分子育种开辟了新的途径。因编码甜菜碱醛脱氢酶基因BADH2功能缺失后,可导致一个主要的香气化合物2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量增多,使稻米产生香味。因此,本文利用CRISPR/Cas9靶向编辑技术,针对BADH2第2外显子和第7外显子分别设计靶标位点Badh2KO1和Badh2KO2,通过水稻遗传转化共获得转基因植株94株。通过对94株转化植株的BADH2基因测序结果可知,Badh2KO1的突变植株为25株,突变率27%;Badh2KO2的突变植株为59株,突变率63%;野生型植株为10株。通过遗传分离得到纯合突变植株。Sanger测序证实这些突变植株中BADH2基因发生碱基缺失和插入,致使编码蛋白的氨基酸序列均有不同程度的改变,且GC-MS技术检测出这些突变植株中的2-AP含量明显提高。这些结果表明,CRISPR/Cas9可以定向编辑水稻香味基因,使稻米具有香味。突变检测是植物CRISPR/Cas9靶向突变研...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR系统Ⅱ型的结构
图 2 CRISPR/Cas9 系统编辑基因的示意图Fig. 2 Schematic diagram of CRISPR/Cas9 systemSPR/Cas9 编辑技术的应用PR/Cas9 技术作为一种基因编辑工具已经应用在许多的的报道不断出现。Fuchs 等[25]应用 CRISPR/Cas9 技术蛋白 eS25 基因进行了定点成功敲除，构建了核糖体蛋Zheng 等[26]设计出双 CRISPR/Cas9 系统，在人类细胞中基因，同时证实在提供同源性修复供体时，靶位点基因im 等[27]将 CRISPR/Cas9 技术应用在人类的纤维细胞和点突变率高达 79%。PR/Cas9 技术出现之后，从事农业科研的工作人员把此中，CRISPR/Cas9 技术成功的编辑了小麦和水稻等作运用到拟南芥基因编辑中，培育出了 ADH1 和 TT4 基种。Shan 等[30]利用 CRISPR/Cas9 技术成功敲掉了小粉病的新品种。该团队还定点突变了水稻 PDS 基因。
图 2-3 T0 代植株 DNA 序列测序结果Fig.2-3 Sequencing results of DNAsequence of T0 generation plants对两种部分转化植株基因测序分析得到的基因型如上图所示：Badh2KO突变型有 1bp 的插入和 1bp 的缺失， Badh2KO2 位点的突变型有 1bp 1bp、2bp、5bp、18bp 的缺失，这些不同的基因突变型很可能来自不能转化。且两个位点的突变都有纯合基因型和杂合基因型。Badh2KO2 位比 Badh2KO1 位点的多 3 种，而且突变型有很大的区别。本实验的基因只有碱基插入和碱基的缺失两种形式，不存在碱基的替换。就突变位置而多发生在 PAM 上游第 3 个碱基的位置。2 T1代植株突变遗传对上述基因型突变的植株 KO1-1、KO1-3、KO1-4、KO2-1、KO2-3、KO2-5、KO2-6、KO2-7 的种子遗传得到 T1代植株。对其 T1代植株的 DNA 测序分析我们可以看到，这 6 个 T0代植株遗传至 T1代时，几乎将自身变型基因遗传到了 T1代。同时有些植株在 T1代又出现了新的突变型
【参考文献】：
期刊论文
[1]从转基因技术角度谈转基因植物的安全性[J]. 叶兴国,杜丽璞. 中国种业. 2016(09)
[2]基因编辑作物的发展及检测监管现状[J]. 付伟,魏霜,王晨光,杜智欣,朱鹏宇,刘中勇,吴希阳,朱水芳. 植物检疫. 2016(03)
[3]CRISPR/Cas9系统——靶向基因组编辑的新策略[J]. 赵海卫,吕欣,尹文. 中国病原生物学杂志. 2015(03)
[4]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[5]植物安全转基因技术研究现状与展望[J]. 王根平,杜文明,夏兰琴. 中国农业科学. 2014(05)
[6]我国水稻育种技术发展历程回顾[J]. 王月华,何虎,潘晓华. 江西农业学报. 2012(02)
[7]转基因技术及其在水稻育种中的研究进展[J]. 肖小君,王辉,齐泽民,黄作喜. 井冈山大学学报(自然科学版). 2011(05)
[8]中国杂交水稻和水稻分子育种研究与发展概况[J]. 万昕,李海林,罗斌,徐庆国. 作物研究. 2009(05)
[9]水稻香味基因的研究进展[J]. 唐傲,邵高能,胡培松. 中国稻米. 2009(04)
[10]超级稻的分子设计育种[J]. 万建民. 沈阳农业大学学报. 2007(05)
本文编号：3587570
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR系统Ⅱ型的结构
图 2 CRISPR/Cas9 系统编辑基因的示意图Fig. 2 Schematic diagram of CRISPR/Cas9 systemSPR/Cas9 编辑技术的应用PR/Cas9 技术作为一种基因编辑工具已经应用在许多的的报道不断出现。Fuchs 等[25]应用 CRISPR/Cas9 技术蛋白 eS25 基因进行了定点成功敲除，构建了核糖体蛋Zheng 等[26]设计出双 CRISPR/Cas9 系统，在人类细胞中基因，同时证实在提供同源性修复供体时，靶位点基因im 等[27]将 CRISPR/Cas9 技术应用在人类的纤维细胞和点突变率高达 79%。PR/Cas9 技术出现之后，从事农业科研的工作人员把此中，CRISPR/Cas9 技术成功的编辑了小麦和水稻等作运用到拟南芥基因编辑中，培育出了 ADH1 和 TT4 基种。Shan 等[30]利用 CRISPR/Cas9 技术成功敲掉了小粉病的新品种。该团队还定点突变了水稻 PDS 基因。
图 2-3 T0 代植株 DNA 序列测序结果Fig.2-3 Sequencing results of DNAsequence of T0 generation plants对两种部分转化植株基因测序分析得到的基因型如上图所示：Badh2KO突变型有 1bp 的插入和 1bp 的缺失， Badh2KO2 位点的突变型有 1bp 1bp、2bp、5bp、18bp 的缺失，这些不同的基因突变型很可能来自不能转化。且两个位点的突变都有纯合基因型和杂合基因型。Badh2KO2 位比 Badh2KO1 位点的多 3 种，而且突变型有很大的区别。本实验的基因只有碱基插入和碱基的缺失两种形式，不存在碱基的替换。就突变位置而多发生在 PAM 上游第 3 个碱基的位置。2 T1代植株突变遗传对上述基因型突变的植株 KO1-1、KO1-3、KO1-4、KO2-1、KO2-3、KO2-5、KO2-6、KO2-7 的种子遗传得到 T1代植株。对其 T1代植株的 DNA 测序分析我们可以看到，这 6 个 T0代植株遗传至 T1代时，几乎将自身变型基因遗传到了 T1代。同时有些植株在 T1代又出现了新的突变型
【参考文献】：
期刊论文
[1]从转基因技术角度谈转基因植物的安全性[J]. 叶兴国,杜丽璞. 中国种业. 2016(09)
[2]基因编辑作物的发展及检测监管现状[J]. 付伟,魏霜,王晨光,杜智欣,朱鹏宇,刘中勇,吴希阳,朱水芳. 植物检疫. 2016(03)
[3]CRISPR/Cas9系统——靶向基因组编辑的新策略[J]. 赵海卫,吕欣,尹文. 中国病原生物学杂志. 2015(03)
[4]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[5]植物安全转基因技术研究现状与展望[J]. 王根平,杜文明,夏兰琴. 中国农业科学. 2014(05)
[6]我国水稻育种技术发展历程回顾[J]. 王月华,何虎,潘晓华. 江西农业学报. 2012(02)
[7]转基因技术及其在水稻育种中的研究进展[J]. 肖小君,王辉,齐泽民,黄作喜. 井冈山大学学报(自然科学版). 2011(05)
[8]中国杂交水稻和水稻分子育种研究与发展概况[J]. 万昕,李海林,罗斌,徐庆国. 作物研究. 2009(05)
[9]水稻香味基因的研究进展[J]. 唐傲,邵高能,胡培松. 中国稻米. 2009(04)
[10]超级稻的分子设计育种[J]. 万建民. 沈阳农业大学学报. 2007(05)
本文编号：3587570
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/3587570.html
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