二化螟和褐飞虱为害诱导型水稻启动子的克隆及功能分析

发布时间：2022-08-29 20:10

　　植物与植食性昆虫长期协同进化过程中,逐渐形成了多种复杂但极精巧的防御反应,用以抵御昆虫的为害。其中茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号途径和绿叶挥发性物质途径（green leaf volatiles,GLVs）是植物防御反应的核心。丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase,AOS）与脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase,HPL）可以催化相同底物分别生成JA与GLVs,AOS与HPL应对不同昆虫为害表现出很高的特异性,影响JA与GLVs的生成量,进而决定植物防御反应的特异性。但目前,有关AOS与HPL基因对害虫为害应答机制的研究还未见报道。因此,本研究拟克隆水稻AOS及HPL基因的启动子,探究两种启动子对刺吸式口器昆虫褐飞虱与咀嚼式口器昆虫二化螟的应答模式,利用启动子5’端渐次缺失、GUS活性测定、GUS组织化学染色、启动子抗虫活性测定等方法,鉴定AOS及HPL启动子中对褐飞虱与二化螟为害产生应答的功能区域。从启动子结构层面解析AOS及HPL基因对害虫为害的应答机制,揭示水稻对不同口器害虫做出特异防御反应的内在原因。在此基础上,用克隆... 

【文章页数】：260 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
    1 前言
        1.1 植物对昆虫防御反应的研究进展
            1.1.1 植物对昆虫防御反应的类型
            1.1.2 引起植物抗虫反应的激发子
            1.1.3 植物对咀嚼式口器昆虫防御反应的机理
            1.1.4 植物对刺吸式口器昆虫防御反应的机理
            1.1.5 植物针对咀嚼式与刺吸式口器昆虫防御反应的差异
        1.2 水稻对昆虫防御反应的研究进展
            1.2.1 水稻主要害虫及其为害
            1.2.2 二化螟简介
            1.2.3 褐飞虱简介
            1.2.4 水稻对二化螟及褐飞虱防御反应的研究进展
        1.3 丙二烯氧化物合酶及脂氢过氧化物裂解酶的研究进展
            1.3.1 植物丙二烯氧化物合酶的研究进展
            1.3.2 水稻丙二烯氧化物合酶的研究进展
            1.3.3 植物脂氢过氧化物裂解酶的研究进展
            1.3.4 水稻脂氢过氧化物裂解酶的研究进展
        1.4 启动子的概述
            1.4.1 原核生物启动子的结构与功能
            1.4.2 真核生物启动子的结构与功能
        1.5 植物启动子的类型
            1.5.1 诱导型启动子
            1.5.2 组成型启动子
            1.5.3 组织特异型启动子
            1.5.4 人工合成启动子
        1.6 启动子研究常用方法与技术
            1.6.1 启动子生物信息学分析
            1.6.2 候选基因表达模式检测
            1.6.3 启动子的分离
            1.6.4 启动子表达强度的定量及定性分析
            1.6.5 启动子顺式元件及反式作用因子鉴定分析
        1.7 诱导型启动子分析在植物抗虫机理研究中的作用
        1.8 诱导型启动子分析在植物抗虫应用研究中的作用
    2 目的意义及创新点
        2.1 目的意义
        2.2 本研究的创新点
第二章 水稻中昆虫诱导型启动子克隆及功能分析
    1 试验材料
        1.1 水稻材料
        1.2 供试昆虫
        1.3 菌株及质粒
        1.4 酶及化学试剂
        1.5 主要常用仪器
        1.6 序列分析
        1.7 候选基因信息
            1.7.1 OsHPL2候选基因信息
            1.7.2 OsAOS1候选基因信息
    2 试验方法
        2.1 验证候选基因
            2.1.1 水稻接虫及激素处理
            2.1.2 水稻叶鞘组织RNA抽提及反转录
            2.1.3 Os HPL2及Os AOS1 候选基因表达量检测
        2.2 启动子的克隆、载体构建及遗传转化
            2.2.1 启动子序列分析
            2.2.2 全长及系列5’端缺失启动子的克隆及载体构建
            2.2.3 农杆菌介导的水稻遗传转化
        2.3 转基因植株检测
            2.3.1 转基因植株阳性检测
            2.3.2 转基因植株拷贝数检测
            2.3.3 转基因植株纯合家系检测
        2.4 GUS组织化学染色
        2.5 GUS活性定量测定
            2.5.1 所用试剂配制
            2.5.2 总蛋白的抽提
            2.5.3 总蛋白浓度测定
            2.5.4 GUS活性测定
        2.6 二化螟为害正调控序列驱动cry1C基因功能验证
            2.6.1 二化螟为害正调控序列启动子载体构建
            2.6.2 Cry1C的 ELISA检测
            2.6.3 二化螟初孵幼虫死亡率检测
        2.7 P2、P2R123-min35S、P2TR2-min35S转基因植株农艺性状考查
        2.8 褐飞虱为害正调控序列缺失突变体启动子构建
        2.9 酵母单杂交筛选互作蛋白
        2.10 互作蛋白EGY48酵母菌株“点对点”验证
        2.11 水稻原生质体瞬时转化
        2.12 双荧光素酶激活实验
        2.13 P_(AOS1)中与正调控序列互作蛋白的表达模式
    3 结果与分析
        3.1 水稻中二化螟为害诱导启动子P_(HPL2)的克隆及功能分析
            3.1.1 二化螟为害诱导候选基因的表达检测
            3.1.2 激素和机械损伤处理下OsHPL2表达检测
            3.1.3 P_(HPL2)转基因植株拷贝数及纯合家系检测
            3.1.4 P_(HPL2) 启动子驱动下,GUS的表达特性
            3.1.5 P_(HPL2)系列缺失启动子转基因植株拷贝数及纯合家系检测
            3.1.6 P_(HPL2)系列缺失启动子组织化学染色分析
            3.1.7 P_(HPL2)及其系列缺失启动子GUS活性定量测定
            3.1.8 P-1452、P-903和P-376对褐飞虱为害的反应
            3.1.9 二化螟为害诱导正调控序列中潜在顺式元件分析
            3.1.10 二化螟幼虫为害不同启动子驱动cry1C转基因水稻的死亡率
            3.1.11 二化螟幼虫为害后,不同启动子驱动cry1C转基因水稻中Cry1C蛋白含量ELISA检测
            3.1.12 不同启动子驱动cry1C转基因水稻对激素和机械损伤的反应
            3.1.13 转基因植株田间农艺性状考查
        3.2 水稻中褐飞虱为害诱导启动子P_(AOS1)的克隆及功能分析
            3.2.1 褐飞虱为害诱导候选基因的表达检测
            3.2.2 激素和机械损伤处理下OsAOS1表达检测
            3.2.3 P_(AOS1)转基因植株拷贝数及纯合家系检测
            3.2.4 P_(AOS1)启动子驱动下,GUS的表达特性
            3.2.5 P_(AOS1)系列缺失启动子转基因植株拷贝数及纯合家系检测
            3.2.6 P_(AOS1)系列缺失启动子组织化学染色分析
            3.2.7 P_(AOS1)及其系列缺失启动子GUS活性定量测定
            3.2.8 P-1573、P-979和P-426对二化螟为害的反应
            3.2.9 褐飞虱为害诱导正调控序列中潜在顺式元件分析
            3.2.10 正调控序列缺失突变体启动子GUS活性定量测定
            3.2.11 筛选与褐飞虱为害诱导正调控序列互作的蛋白
            3.2.12 酵母单杂交验证候选蛋白
            3.2.13 互作蛋白的双荧光素酶激活验证
            3.2.14 互作蛋白受褐飞虱与二化螟为害后表达检测
    4 讨论
        4.1 二化螟与褐飞虱接虫实验方法探讨
        4.2 二化螟为害诱导正调控区域用于转基因抗虫水稻的潜力
        4.3 P_(HPL2)和P_(AOS1)可能的诱导表达模式
        4.4 P_(HPL2)和P_(AOS1)中顺式元件分析
        4.5 P_(AOS1)启动子上的结合蛋白
        4.6 昆虫为害诱导型启动子研究展望
参考文献
附录
    附录 Ⅰ:部分实验操作步骤
    附录 Ⅱ:部分实验图
    附录 Ⅲ:核苷酸序列
    附录 Ⅳ:水稻受二化螟与褐飞虱为害的转录组分析
    附录 Ⅴ:作者简介
致谢



本文编号：3678935