利用CRISPR/Cas9技术改良水稻株高、抽穗期和品质相关性状的初步探讨

发布时间：2022-10-08 14:14

　　水稻的杂交育种耗时长、操作复杂,且难以达到性状定向改良的目的。利用CRISPR/Cas9技术进行基因的定点编辑已经在水稻中得到了成功的运用。我们使用CRISPR/Cas9技术定向改良了水稻性状,挑选wx、fgr、sd1、hd1、ghd7.1、GS3为候选靶基因,设计它们的CRISPR/Cas9编辑载体,通过农杆菌侵染法构建这些载体在不同水稻材料中的突变体。通过杂交或自交的方法,得到无T-DNA插入的水稻。此方法一方面可以快速定向改良水稻性状,另一方面,也可以创建突变体,提供新型种质资源。主要结果如下:1.根据候选基因设计靶点,将两个候选基因的靶点同时构建到CRISPR/Cas9编辑载体。使用农杆菌介导的遗传转化法分别获得了华2613S-wx-fgr、贵州香禾糯-sd1-ghd7.12、贵州香禾糯-hd1-ghd7.11、香玉玻-GS3的T₀代转基因植株。2.使用自交和杂交的方法获得双基因纯合的功能突变型华2613S-wx1-fgr2、贵州香禾糯-sd1-ghd7.12、贵州香禾糯-hd1-ghd7.11植株。3.考察T1代贵州香禾糯-hd1-ghd7.11、T

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摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
    1.1 目的基因研究背景
        1.1.1 Wx基因的研究背景
        1.1.2 fgr基因的研究背景
        1.1.3 SD1基因的研究背景
        1.1.4 抽穗期相关基因的研究背景
        1.1.5 GS3基因的研究背景
    1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术概述
        1.2.1 CRISPR-Cas系统的结构
        1.2.2 CRISPR-Cas系统的适应免疫机制
        1.2.3 CRISPR-Cas系统的分类
        1.2.4 CRISPR/Cas9系统在水稻中的应用
    1.3 本研究的目的意义
第一章 利用CRISPR/Cas9技术改良贵州香禾糯的株高和抽穗期
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 供实验用水稻
            2.1.2 菌株和质粒
        2.2 实验方法
            2.2.1 CRISPR敲除载体的构建
            2.2.2 农杆菌介导的水稻的遗传转化
            2.2.3 水稻米质的测定方法
    3 结果与分析
        3.1 双靶点CRISPR/Cas9载体构建
            3.1.1 U6/U3-sgRNA载体的构建
            3.1.2 sgRNA载体与pCXUN载体的连接
        3.2 CRISPR/Cas9转基因植株T_0代的获取和阳性鉴定结果
            3.2.1 农杆菌介导的遗传转化
            3.2.2 转基因阳性单株的筛选
        3.3 CRISPR/Cas9转基因植株的突变类型
        3.4 贵州香禾糯突变体突变基因型功能分析
            3.4.1 sd1突变基因型功能分析
            3.4.2 Hd1突变基因型功能分析
            3.4.3 Ghd7.1突变基因型功能分析
        3.5 转基因植株的表型鉴定
            3.5.1 贵州香禾糯突变体株高和抽穗期的表型鉴定
            3.5.2 贵州香禾糯突变体农艺性状表型考察
            3.5.3 贵州香禾糯突变体品质性状表型考察
第二章 利用CRISPR/Cas9技术将水稻不育系华2613S改为香糯型
    2 材料与方法
    3 结果与分析
        3.1 双靶点CRISPR/Cas9载体构建
        3.2 CRISPR/Cas9转基因植株T0代的获取和阳性鉴定结果
        3.3 CRISPR/Cas9转基因植株的突变类型
        3.4 华 2613S突变体突变基因型功能分析
            3.4.1 wx突变基因型功能分析
            3.4.2 fgr突变基因型功能分析
        3.5 华 2613S突变体直链淀粉含量及香味性状的表型鉴定
第三章 利用CRISPR/Cas9技术改良香玉玻粒型
    2 材料与方法
    3 结果与分析
        3.1 单靶点CRISPR/Cas9载体构建
        3.2 CRISPR/Cas9转基因植株T0代的获取和阳性鉴定结果
        3.3 CRISPR/Cas9转基因植株的突变类型
        3.4 香玉玻突变体GS3突变基因型功能分析
        3.5 香玉玻突变体粒长性状考察结果
    4 讨论
        4.1 sd1基因不同突变体与株高的关系
        4.2 Hd1基因与Ghd7.1基因对抽穗期的影响
        4.3 抽穗期与日照时间的探讨
        4.4 贵州香禾糯突变体材料非目的性状变异
        4.5 wx基因调控水稻籽粒的直链淀粉含量
        4.6 突变体材料的筛选
参考文献
附录
    附录 1：本研究中所用引物
    附录 2：部分实验的详细步骤
        Protocol 1: SSR技术路线
        Protocol 2: 载体构建和遗传转化中各核心实验步骤
        Protocol 3: 水稻粳稻遗传转化体系
        Protocol 4: 水稻籼稻遗传转化体系
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]我国华北地区粳稻品种抽穗期遗传分析[J]. 魏祥进,江玲,徐俊锋,陆广文,王洪俊,王智权,翟虎渠,万建民.  中国水稻科学. 2009(06)
[2]利用染色体片段代换系定位水稻主效抽穗期QTL[J]. 邵迪,李秋萍,吴比,邢永忠.  湖南农业大学学报(自然科学版). 2009(04)
[3]Relationship Between the First Base of the Donor Splice Site of Waxy Gene Intron 1 and Amylose Content in Yunnan Indigenous Rice Varieties[J]. ZHANG Ya-li1,2, XU Ming-hui1, ZENG Ya-wen1, YAO Chun-xin1, CHEN Shan-na2 (1 Key Laboratory of Biotechnology Research of Yunnan Province, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China; 2 College of Life Science, Yunnan University, Kunming 650091, China).  Rice Science. 2007(03)
[4]水稻抽穗期基因研究进展[J]. 董春林,孙业盈,邓晓建.  中国农学通报. 2005(06)
[5]染色体单片段代换系的构建及应用于QTL精细定位[J]. 张丽霞,刘丕庆,刘学义.  分子植物育种. 2004(05)
[6]水稻蜡质基因引导区的两个SSR序列与直链淀粉含量的相关性（英文）[J]. 谈移芳,张启发.  植物学报. 2001(02)
[7]籼稻和粳稻中蜡质基因座位上微卫星标记的多态性及其与直链淀粉含量的关系[J]. 舒庆尧,吴殿星,夏英武,高明尉.  遗传学报. 1999(04)
[8]水稻蜡质基因5’非翻译区一个与调控有关的内含子[J]. 蔡秀玲,王宗阳,郑霏琴,洪孟民.  植物生理学报. 1997(03)

博士论文
[1]农杆菌介导的水稻转基因研究[D]. 林拥军.华中农业大学 2001



本文编号：3687860