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蓝铜蛋白GhBCP4与GhCrRLK蛋白互作参与棉纤维发育分子机制研究

发布时间:2023-01-30 14:49
  棉花(Gossypium hirsutum)是世界上最重要的经济作物之一,棉纤维作为一种天然纤维,是纺织工业的主要原料。棉纤维是由棉花胚珠表皮细胞极性伸长发育而来的一种单细胞结构的表皮毛,是研究植物细胞极性伸长和细胞次生壁合成的理想的生物材料。蓝铜蛋白(Blue Copper-binding Protein,BCP)是一类铜离子结合蛋白,广泛参与植物生长发育及逆境胁迫应答反应。在前期工作中我们从棉花中分离得到了一个纤维优势表达基因GhBCP4,对其在棉纤维发育中的功能进行了研究,结果如下:1、GhBCP4蛋白亚细胞定位分析蛋白结构预测显示,GhBCP4蛋白N端有信号肽(SP),C端有GPI锚定位点,铜离子结合结构域位于两者之间。为研究该蛋白的细胞亚定位,我们构建了多个GhBCP4与eGFP融合表达载体,进行棉花转化实验。结果显示,将eGFP报告蛋白放置于GhBCP4的C末端,在棉花阳性愈伤组织细胞中检测不到荧光信号;去掉GhBCP4蛋白的SP和GPI位点后,剩余的中间序列与eGFP融合表达,发现荧光信号主要集中于棉花细胞的液泡中;将eGFP序列插入到GhBCP4的铜离子结合结构域与GP... 

【文章页数】:95 页

【学位级别】:硕士

【文章目录】:
摘要
Abstract
一、引言
    1.1 棉纤维研究进展
        1.1.1 棉纤维概述
        1.1.2 棉纤维发育过程
        1.1.3 棉纤维发育分子机制
    1.2 植物细胞壁概述
        1.2.1 纤维素
        1.2.2 半纤维素
        1.2.3 木质素
    1.3 蓝铜蛋白研究进展
        1.3.1 蓝铜蛋白概述
        1.3.2 植物蓝铜蛋白
    1.4 类受体激酶研究进展
        1.4.1 类受体激酶概述
        1.4.2 类受体激酶CrRLKs研究进展
    1.5 快速碱化因子研究进展
    1.6 立题依据及研究意义
二、材料与方法
    2.1 实验材料及器材
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌种及载体
        2.1.3 工具酶和化学试剂、试剂盒
        2.1.4 常用储液及缓冲液
        2.1.5 常用培养基
        2.1.6 实验仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 转基因棉花材料的培养及材料收取
        2.2.2 棉花基因组DNA的提取及阳性苗鉴定
        2.2.3 转基因材料转录组测序
        2.2.4 棉纤维材料收取及RNA提取、消化、逆转录
        2.2.5 实时荧光定量PCR
        2.2.6 石蜡切片的制备及染色观察
        2.2.7 转基因棉花纤维的细胞壁(AIR)提取及结晶纤维素含量测定
        2.2.8 载体构建
        2.2.9 农杆菌LBA4404介导的棉花遗传转化
        2.2.10 酵母感受态细胞AH109、Y187的制备及转化
        2.2.11 酵母双杂交实验
        2.2.12 双分子荧光互补实验
        2.2.13 重组蛋白诱导表达
三、实验结果
    3.1 GhBCP4蛋白亚细胞定位分析
        3.1.1 pB1121::GhBCP4::eGFP融合表达载体的构建
        3.1.2 pBI121::GhBCP4::eGFP融合表达载体的转化
        3.1.3 GhBCP4蛋白亚细胞定位
    3.2 T3、T4代GhBCP4转基因棉花鉴定及棉纤维表型分析
        3.2.1 T3代GhBCP4转基因棉花表达量检测及棉纤维表型分析
        3.2.2 T4代GhBCP4转基因棉花的阳性苗鉴定
        3.2.3 T4代GhBCP4转基因棉花的棉纤维表型分析
    3.3 GhBCP4转基因材料转录组数据分析
        3.3.1 差异表达基因筛选
        3.3.2 差异基因GO富集柱状图
        3.3.3 GhBCP4转基因株系与野生型相比差异基因的KEGG分析
    3.4 转录组数据验证
    3.5 GhBCP4转基因材料纤维素含量测定
        3.5.1 GhBCP4转基因材料石蜡切片分析
        3.5.2 GhBCP4转基因材料细胞壁组分提取及纤维素含量测定
    3.6 GhBCP4互作蛋白的筛选
        3.6.1 蛋白互作相关载体的构建
        3.6.2 BIFC实验探究GhBCP4与GhCrRLK蛋白互作
        3.6.3 酵母双杂交实验探究GhBCP4与GhCrRLK蛋白互作
        3.6.4 Pull-Down实验探究GhBCP4与GhCrRLK蛋白互作
四、讨论
    4.1 GhBCP4促进棉纤维细胞伸长发育及可能调控机制
    4.2 GhBCP4与GhCrRLK协同调控棉纤维发育
    4.3 RALF可能参与GhBCP4棉纤维伸长发育
参考文献
缩写表
硕士期间发表的论文
致谢


【参考文献】:
期刊论文
[1]漆酶在环境保护中的应用研究进展[J]. 马倩倩,赵丽红,陈威.  工业安全与环保. 2019(08)
[2]拟南芥RALF多肽家族的功能多样性初步分析[J]. 强晓楠,李鑫,陈佳,廖红东,于峰.  生物技术通报. 2019(01)
[3]棉纤维发育的遗传特性及相关基因的研究进展[J]. 毛玮,曹跃芬.  浙江农林大学学报. 2018(06)
[4]植物受体激酶BAK1介导的细胞死亡调控研究进展[J]. 冯丽平,黎艳,蒋亨珂,孙歆,袁明,杜俊波.  中国细胞生物学学报. 2018(11)
[5]棉花功能基因组研究进展[J]. 左东云,叶武威,程海亮,王德龙,张友平,王俊娟,王巧连,陈修贵,陆许可,宋国立.  棉花学报. 2017(S1)
[6]番茄漆酶基因LeLACmiR397的克隆与表达分析[J]. 赵先炎,庞明利,赵强,任怡然,郝玉金,由春香.  园艺学报. 2015(07)
[7]植物RLCK的生物学功能与信号途径研究进展[J]. 何含杰,张党权,唐丽,杨丹.  植物生理学报. 2014(07)
[8]类受体蛋白激酶与植物非生物胁迫应答[J]. 曹玉婷,丁艳菲,朱诚.  中国生物化学与分子生物学报. 2014(03)
[9]BAK1调控植物免疫信号识别和转导的分子机制[J]. 陈现朝,周永力.  植物遗传资源学报. 2013(06)
[10]中国棉花纤维品质检验和评价的研究进展[J]. 熊宗伟,王雪姣,顾生浩,毛丽丽,张立祯,周治国.  中国棉麻流通经济. 2013 (05)

博士论文
[1]棉花纤维伸长相关miRNA的筛选及功能验证[D]. 刘国元.中国农业科学院 2019
[2]植物应答环境信号的两个相关基因功能研究[D]. 于峰.湖南师范大学 2013
[3]水稻类受体蛋白激酶DIS1和DIS2的功能研究[D]. 韩永峰.河北师范大学 2010

硕士论文
[1]小麦镉积累影响秸秆细胞壁组成及乙醇产率的研究[D]. 程亮亮.华中农业大学 2019
[2]雷蒙德氏棉HD-Zip基因家族进化及选择性剪切分析[D]. 薛宇.浙江农林大学 2014



本文编号:3733177

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