矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因转化玉米

发布时间：2023-02-07 21:42

　　干旱等非生物逆境是玉米生产的主要限制因素。培育推广耐旱品种是克服干旱威胁最为经济有效的措施。但是,玉米整个物种对水分敏感,耐旱性强的种质资源缺乏,常规育种对耐旱性的改良进展不大,难以满足农业生产的需求。转基因技术可克隆物种间的生殖障碍,转化利用基因其他物种的耐旱基因,为耐旱玉米品种的培育提供了新的途径。矮沙冬青是分布于干旱沙漠地带的超旱生植物,对干旱、盐碱、极端温度等非生物逆境耐受性极强。在前期研究中,课题组从矮沙冬青克隆了液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AnVP1,并转化酵母和拟南芥突变体验证其抗性功能。本研究用以构建AnVP1基因单子叶植物表达载体,农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过筛选、分化再生植株,PCR检测外源基因整合的阳性株系,定量PCR检测AnVP1基因的过量表达,并进行初步的盆栽耐旱性鉴定,试图为耐旱玉米品种培育创造新种质。主要结果如下:(1)将矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AnVP1、玉米泛素启动子Ubiquitin和农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子T-nos,成功插入pZZ00026质粒,构建成AnVP1基因单子叶表达载体pZZ00026-Ubi-AnVP1-T-nos,...

【文章页数】：44 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 干旱是玉米生产的主要限制因素
    1.2 矮沙冬青
        1.2.1 矮沙冬青的抗逆生物学特性
        1.2.2 矮沙冬青抗逆基因克隆与功能验证
    1.3 液泡膜氢离子焦磷酸酶
        1.3.1 液泡膜氢离子焦磷酸酶的发现
        1.3.2 液泡膜氢离子焦磷酸酶的分子结构
        1.3.3 液泡膜氢离子焦磷酸酶的功能
        1.3.4 液泡膜氢离子焦磷酸酶基因的转化利用
    1.4 技术路线与目的意义
2 材料和方法
    2.1 AnVP1基因单子叶植物表达载体构建
        2.1.1 目的片段扩增与回收
        2.1.2 酶切与连接
        2.1.3 大肠杆菌感受态细胞制备与热激转化
        2.1.4 菌液PCR检测
        2.1.5 质粒提取与检测
        2.1.6 农杆菌的转化与检测
    2.2 农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织
        2.2.1 培养基配方
        2.2.2 愈伤组织培养与转化
        2.2.3 愈伤组织的筛选与再生
    2.3 T₀和T₁代的检测与筛选
        2.3.1 基因组DNA提取
        2.3.2 T₀代单株的PCR检测
        2.3.3 T₁代田间抗性筛选和PCR检测
    2.4 AnVP1基因的表达检测
        2.4.1 胁迫处理和总RNA提取
        2.4.2 反转录合成cDNA
        2.4.3 实时定量PCR检测
    2.5 T₂代株系的表型观察
3 结果与分析
    3.1 AnVP1基因单子叶植物表达载体
        3.1.1 AnVP1基因、Ubiquitin目启动子和T-nos终止子
        3.1.2 表达载体pZZ00026-Ubi-An VP1-T-nos
        3.1.3 重组农杆菌菌株
    3.2 转基因株系
        3.2.1 抗性愈伤组织与再生苗
        3.2.2 T₀代植株
        3.2.3 T₁代株系
    3.3 AnVP1基因的过量表达
        3.3.1 总RNA样品质量
        3.3.2 引物特异性
        3.3.3 标准曲线
        3.3.4 AnVP1基因的过量表达
    3.4 转基因株系的抗性表型
4 讨论
    4.1 不同转化事件间AnVP1基因的表达差异
    4.2 矮沙冬青AnVP1基因与玉米中ZmVPP1基因的比较
5 应用前景
参考文献
致谢



本文编号：3737471