MeFtsZ1基因调节木薯淀粉体分裂研究
发布时间：2023-02-19 07:47
木薯块根富含淀粉,是热带及亚热带地区重要的粮食作物,同时木薯淀粉在工业上具有广泛的用途。淀粉粒的大小是影响淀粉特性及其工业应用的重要因素。淀粉体是植物贮藏器官合成及积累淀粉粒的场所,淀粉粒的大小与淀粉体的体积密切相关。淀粉体与叶绿体都由前质体发育而成,它们的分裂与增殖都是在质体分裂相关蛋白的精确调控下完成的,这些蛋白表达量的改变将会干扰质体的正常分裂,形成较大的质体。FtsZ 蛋白(Filamenting temperature-sensitive mutantZ)可以在质体分裂位点聚集形成FtsZ环(Z环)为质体的分裂提供动力,FtsZ是质体分裂的关键基因。本实验室前期已经从木薯基因组中克隆获得3个FtsZ基因(MeFtsZ1、MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2),并发现它们的表达与木薯块根淀粉的积累有关。本研究将木薯3个MeFtsZ基因在拟南芥植株中表达,以探讨MeFtsZ基因在木薯质体分裂过程中的作用;同时利用块根特异启动子,在木薯块根中对MeFtsZ1基因进行过量表达和反义抑制,为最终实现木薯淀粉体及淀粉粒的基因工程遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.将3个MeFtsZ...
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 植物质体分裂研究进展
1.1.1 质体的起源
1.1.2 质体分裂机制
1.1.3 质体分裂相关蛋白的研究
1.2 FtsZ基因的研究进展
1.2.1 FtsZ基因及其特征
1.2.2 FtsZ蛋白与其他蛋白之间的相互作用
1.2.3 FtsZ蛋白与淀粉品质改良的相关性
1.3 木薯及其淀粉的研究进展
1.3.1 关于木薯
1.3.2 木薯淀粉的经济价值
1.3.3 木薯淀粉品质改良的研究进展
1.4 转基因技术及其在木薯育种中的应用
1.5 本研究的目的与意义
1.6 技术路线
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂与材料
2.1.1 主要仪器
2.1.2 植物实验材料
2.1.3 载体与菌株
2.2 木薯FtsZ基因融合GFP基因植物表达载体的构建
2.2.1 引物设计
2.2.2 PCR扩增MeFtsZ基因
2.2.3 PCR产物的纯化
2.2.4 基因及载体的双酶切
2.2.5 酶切产物的回收
2.2.6 基因与植物表达载体连接
2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.2.8 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
2.2.9 菌液PCR筛选阳性克隆及测序分析
2.2.10 质粒的提取
2.2.11 质粒的PCR及酶切验证
2.3 表达载体转化LBA4404根癌农杆菌
2.3.1 LBA4404根癌农杆菌感受态细胞的制备
2.3.2 植物表达载体转化LBA4404根癌农杆菌感受态细胞
2.3.3 重组农杆菌的筛选与鉴定
2.4 拟南芥转化
2.4.1 拟南芥种子的无菌种植
2.4.2 拟南芥的转化
2.4.3 拟南芥阳性植株的筛选及移栽
2.5 转基因拟南芥的分子鉴定
2.5.1 转基因拟南芥基因组DNA的小量提取
2.5.2 转基因拟南芥的PCR鉴定
2.5.3 转基因拟南芥总RNA的提取及反转录
2.5.4 转基因拟南芥的RT-PCR鉴定
2.6 转基因拟南芥表型鉴定
2.6.1 拟南芥叶片树脂半薄切片的制片及电子透射显微镜的观察
2.6.2 转基因拟南芥叶绿体观察及数目统计
2.7 转基因拟南芥中质体分裂相关基因的表达量分析
2.8 MeFtsZ1基因的块根过量表达载体构建
2.8.1 引物设计
2.8.2 PCR扩增MeFtsZ1基因
2.8.3 PCR产物的纯化
2.8.4 MeFtsZ1基因及载体的双酶切
2.8.5 酶切产物的回收
2.8.6 MeFtsZ1基因连接植物表达载体
2.8.7 菌液PCR筛选阳性克隆、测序
2.8.8 pVKH-SpoA-MeFtsZ1质粒的提取及鉴定
2.9 MeFtsZ1基因的块根反义表达载体的构建
2.9.1 引物设计
2.9.2 反义片段的PCR扩增
2.9.3 反义片段的纯化
2.9.4 反义片段及载体的双酶切
2.9.5 目的片段的回收、连接及转化
2.9.6 阳性克隆筛选、测序
2.9.7 pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1的质粒提取、PCR及酶切验证
2.10 华南8号木薯的遗传转化及分子鉴定
2.10.1 工程菌液的制备
2.10.2 木薯遗传转化相关培养基配制
2.10.3 木薯体细胞胚的诱导及子叶的形成
2.10.4 农杆菌侵染木薯子叶及植株再生
2.10.5 转基因木薯组培苗的PCR鉴定
2.10.6 转基因木薯植株的炼苗、移栽
2.10.7 转基因木薯的田间种植及样品采集
2.10.8 转基因木薯块根淀粉体观察
2.10.9 转基因木薯的质体分裂相关基因表达分析
2.10.10 转基因木薯的Soutern-blot分析
2.11 转基因木薯块根淀粉合成关键酶(AGPase,GBSS,SSS,SBE)的酶活性分析
2.11.1 块根粗酶液的制备
2.11.2 AGPase的酶活性分析
2.11.3 GBSS和SSS的酶活性分析
2.11.4 SBE的酶活性分析
2.12 转基因木薯块根淀粉特性分析
2.12.1 木薯块根淀粉的提取
2.12.2 淀粉特性分析
3 结果与分析
3.1 植物表达载体MeFtsZ1-GFP、MeFtsZ2-1-GFP相MeFtsZ2-2-GFP的构建
3.2 木薯FtsZ基因在拟南芥质体分裂中的作用
3.2.1 FtsZ基因在拟南芥中的转化
3.2.2 转基因拟南芥基因组DNA提取
3.2.3 转基因拟南芥的PCR鉴定
3.2.4 转基因拟南芥总RNA的提取
3.2.5 转基因拟南芥的RT-PCR鉴定
3.2.6 转基因拟南芥的表型观察
3.2.7 转基因拟南芥中叶绿体数目及叶绿素的变化
3.2.8 转基因拟南芥中质体分裂相关基因的表达量分析
3.3 MeFtsZ1基因在木薯块根的过量表达及反义抑制
3.3.1 MeFtsZ1基因的块根过量表达载体的构建
3.3.2 MeFtsZ1基因的块根反义表达载体的构建
3.3.3 木薯的遗传转化
3.3.4 转基因木薯的基因组DNA提取
3.3.5 木薯转基因植株的PCR鉴定
3.3.6 转基因木薯组培苗的炼苗及移栽
3.3.7 转基因木薯的淀粉体观察
3.3.8 MeFtsZ1在转基因木薯的表达及质体分裂相关基因的表达分析
3.3.9 转基因木薯的Soutern-blot分析
3.4 转基因木薯的田间生长测定
3.4.0 株高的测定
3.4.1 叶长的测定
3.4.2 叶宽的测定
3.4.3 叶柄长的测定
3.4.4 叶片数的统计
3.4.5 茎粗的测定
3.4.6 块根长度的测定
3.4.7 块根直径的测定
3.5 转基因木薯的淀粉合成相关酶分析
3.6 产量性状分析
3.7 转基因木薯的淀粉特性分析
3.7.1 淀粉体观察及淀粉粒度分析
3.7.2 淀粉粘度分析
3.7.3 淀粉热特性分析
4 讨论
4.1 MeFtsZ蛋白定位于叶片中的叶绿体上
4.2 转MeFtsZ基因影响拟南芥叶绿体的分裂
4.3 MeFtsZ1基因参与木薯块根淀粉体的分裂
4.4 木薯淀粉体分裂与淀粉粒大小、形态的关系
4.5 转MeFtsZ1基因对木薯生长及产量的影响
4.6 木薯淀粉粒大小对淀粉粘度特性的影响
4.7 木薯淀粉粒大小对淀粉热特性的影响
5 结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3745818
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 植物质体分裂研究进展
1.1.1 质体的起源
1.1.2 质体分裂机制
1.1.3 质体分裂相关蛋白的研究
1.2 FtsZ基因的研究进展
1.2.1 FtsZ基因及其特征
1.2.2 FtsZ蛋白与其他蛋白之间的相互作用
1.2.3 FtsZ蛋白与淀粉品质改良的相关性
1.3 木薯及其淀粉的研究进展
1.3.1 关于木薯
1.3.2 木薯淀粉的经济价值
1.3.3 木薯淀粉品质改良的研究进展
1.4 转基因技术及其在木薯育种中的应用
1.5 本研究的目的与意义
1.6 技术路线
2 实验材料与方法
2.1 实验试剂与材料
2.1.1 主要仪器
2.1.2 植物实验材料
2.1.3 载体与菌株
2.2 木薯FtsZ基因融合GFP基因植物表达载体的构建
2.2.1 引物设计
2.2.2 PCR扩增MeFtsZ基因
2.2.3 PCR产物的纯化
2.2.4 基因及载体的双酶切
2.2.5 酶切产物的回收
2.2.6 基因与植物表达载体连接
2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.2.8 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
2.2.9 菌液PCR筛选阳性克隆及测序分析
2.2.10 质粒的提取
2.2.11 质粒的PCR及酶切验证
2.3 表达载体转化LBA4404根癌农杆菌
2.3.1 LBA4404根癌农杆菌感受态细胞的制备
2.3.2 植物表达载体转化LBA4404根癌农杆菌感受态细胞
2.3.3 重组农杆菌的筛选与鉴定
2.4 拟南芥转化
2.4.1 拟南芥种子的无菌种植
2.4.2 拟南芥的转化
2.4.3 拟南芥阳性植株的筛选及移栽
2.5 转基因拟南芥的分子鉴定
2.5.1 转基因拟南芥基因组DNA的小量提取
2.5.2 转基因拟南芥的PCR鉴定
2.5.3 转基因拟南芥总RNA的提取及反转录
2.5.4 转基因拟南芥的RT-PCR鉴定
2.6 转基因拟南芥表型鉴定
2.6.1 拟南芥叶片树脂半薄切片的制片及电子透射显微镜的观察
2.6.2 转基因拟南芥叶绿体观察及数目统计
2.7 转基因拟南芥中质体分裂相关基因的表达量分析
2.8 MeFtsZ1基因的块根过量表达载体构建
2.8.1 引物设计
2.8.2 PCR扩增MeFtsZ1基因
2.8.3 PCR产物的纯化
2.8.4 MeFtsZ1基因及载体的双酶切
2.8.5 酶切产物的回收
2.8.6 MeFtsZ1基因连接植物表达载体
2.8.7 菌液PCR筛选阳性克隆、测序
2.8.8 pVKH-SpoA-MeFtsZ1质粒的提取及鉴定
2.9 MeFtsZ1基因的块根反义表达载体的构建
2.9.1 引物设计
2.9.2 反义片段的PCR扩增
2.9.3 反义片段的纯化
2.9.4 反义片段及载体的双酶切
2.9.5 目的片段的回收、连接及转化
2.9.6 阳性克隆筛选、测序
2.9.7 pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1的质粒提取、PCR及酶切验证
2.10 华南8号木薯的遗传转化及分子鉴定
2.10.1 工程菌液的制备
2.10.2 木薯遗传转化相关培养基配制
2.10.3 木薯体细胞胚的诱导及子叶的形成
2.10.4 农杆菌侵染木薯子叶及植株再生
2.10.5 转基因木薯组培苗的PCR鉴定
2.10.6 转基因木薯植株的炼苗、移栽
2.10.7 转基因木薯的田间种植及样品采集
2.10.8 转基因木薯块根淀粉体观察
2.10.9 转基因木薯的质体分裂相关基因表达分析
2.10.10 转基因木薯的Soutern-blot分析
2.11 转基因木薯块根淀粉合成关键酶(AGPase,GBSS,SSS,SBE)的酶活性分析
2.11.1 块根粗酶液的制备
2.11.2 AGPase的酶活性分析
2.11.3 GBSS和SSS的酶活性分析
2.11.4 SBE的酶活性分析
2.12 转基因木薯块根淀粉特性分析
2.12.1 木薯块根淀粉的提取
2.12.2 淀粉特性分析
3 结果与分析
3.1 植物表达载体MeFtsZ1-GFP、MeFtsZ2-1-GFP相MeFtsZ2-2-GFP的构建
3.2 木薯FtsZ基因在拟南芥质体分裂中的作用
3.2.1 FtsZ基因在拟南芥中的转化
3.2.2 转基因拟南芥基因组DNA提取
3.2.3 转基因拟南芥的PCR鉴定
3.2.4 转基因拟南芥总RNA的提取
3.2.5 转基因拟南芥的RT-PCR鉴定
3.2.6 转基因拟南芥的表型观察
3.2.7 转基因拟南芥中叶绿体数目及叶绿素的变化
3.2.8 转基因拟南芥中质体分裂相关基因的表达量分析
3.3 MeFtsZ1基因在木薯块根的过量表达及反义抑制
3.3.1 MeFtsZ1基因的块根过量表达载体的构建
3.3.2 MeFtsZ1基因的块根反义表达载体的构建
3.3.3 木薯的遗传转化
3.3.4 转基因木薯的基因组DNA提取
3.3.5 木薯转基因植株的PCR鉴定
3.3.6 转基因木薯组培苗的炼苗及移栽
3.3.7 转基因木薯的淀粉体观察
3.3.8 MeFtsZ1在转基因木薯的表达及质体分裂相关基因的表达分析
3.3.9 转基因木薯的Soutern-blot分析
3.4 转基因木薯的田间生长测定
3.4.0 株高的测定
3.4.1 叶长的测定
3.4.2 叶宽的测定
3.4.3 叶柄长的测定
3.4.4 叶片数的统计
3.4.5 茎粗的测定
3.4.6 块根长度的测定
3.4.7 块根直径的测定
3.5 转基因木薯的淀粉合成相关酶分析
3.6 产量性状分析
3.7 转基因木薯的淀粉特性分析
3.7.1 淀粉体观察及淀粉粒度分析
3.7.2 淀粉粘度分析
3.7.3 淀粉热特性分析
4 讨论
4.1 MeFtsZ蛋白定位于叶片中的叶绿体上
4.2 转MeFtsZ基因影响拟南芥叶绿体的分裂
4.3 MeFtsZ1基因参与木薯块根淀粉体的分裂
4.4 木薯淀粉体分裂与淀粉粒大小、形态的关系
4.5 转MeFtsZ1基因对木薯生长及产量的影响
4.6 木薯淀粉粒大小对淀粉粘度特性的影响
4.7 木薯淀粉粒大小对淀粉热特性的影响
5 结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3745818
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/3745818.html
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