水稻转录因子RST1互作蛋白的鉴定及其耐盐功能分析

发布时间：2023-02-20 19:48

　　转录因子在水稻逆境胁迫应答过程中起到关键的作用,通过揭示转录因子在响应水稻盐胁迫中的作用机制及原理,随后通过基因工程手段改良水稻植物体中的相关基因,促使有效的耐盐基因发挥功能作用,从而达到提高水稻耐盐性的效果。目前已经克隆得到的水稻耐盐相关转录因子大概有30多个,这些基因在调节水稻不同发育时期的耐盐性方面,有着重要的作用。已知的转录因子有DREB,NAC,MYB,MYC,Cys2/His2 zinc finger,bZIP,AP2/ERF,WRKY等几大家族。本论文以实验室前期分离鉴定得到的水稻耐盐突变体rst1为研究对象,利用酵母双杂交技术从水稻基因文库中筛选出与转录因子RST1互作的蛋白质,并构建相关的水稻转基因材料研究其基本生理特征及耐盐性,初步为研究突变体rst1的耐盐机理提供了参考依据。具体研究如下:首先,本研究利用酵母双杂交技术从实验室构建好的水稻基因文库中筛选出与转录因子RST1有互作关系的蛋白质,经过回转验证,最终确定其中的三个阳性互作蛋白,包括 CBSX3(CBS domain containing protein,CDCP)和热激蛋白 Hsp40 及一个未知蛋白。随...

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号及缩略语表
绪论
第一章 文献综述
    1 植物的盐胁迫研究进展
        1.1 土壤盐渍化概述
        1.2 植物适应盐胁迫的机制
            1.2.1 植物对盐胁迫信号的感知
            1.2.2 植物体内Na⁺的转运和解毒通路
    2 转录因子与植物耐盐性
    3 转录因子的修饰
    4 研究目的及意义
第二章 RST1互作蛋白的筛选及验证
    引言
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 pGBKT7-RST1载体的构建
            1.2.1 OsRST1的CDS序列克隆
            1.2.2 基因和载体的酶切:
            1.2.3 质粒的连接
            1.2.4 质粒的转化
            1.2.5 菌落PCR鉴定阳性克隆
            1.2.6 质粒的提取
            1.2.7 双酶切鉴定及测序
        1.3 酵母双杂交筛库
            1.3.1 制备酵母感受态
            1.3.2 转化
            1.3.3 毒性与自激活检测
            1.3.4 酵母融合
        1.4 互作验证
            1.4.1 酵母双杂载体构建
            1.4.2 Pull-down载体构建
            1.4.3 BiFC载体构建
            1.4.4 基因与载体的酶切与连接
            1.4.5 质粒的转化
        1.5 酵母双杂交回转验证
            1.5.1 酵母感受态制备
            1.5.2 质粒共转化
            1.5.3 涂板
            1.5.4 酵母点斑
        1.6 Pull-down
            1.6.1 转化
            1.6.2 原核表达蛋白
            1.6.3 Pull-down
        1.7 双分子荧光互补BiFC
            1.7.1 农杆菌的转化
            1.7.2 农杆菌侵染烟草
    2 结果分析
        2.1 酵母双杂交筛库
            2.1.1 酵母菌落PCR
            2.1.2 酵母质粒提取送样测序
        2.2 回转验证(酵母双杂交)
            2.2.1 CDS全长回转验证
            2.2.2 结构域截段回转验证
        2.3 Pull-down
        2.4 双分子荧光互补BiFC
    3 讨论
第三章 RST1互作蛋白CBSX3的定位及其耐盐功能分析
    引言
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 OsCBSX3的表达模式分析
            1.2.1 组织定量
            1.2.2 GUS组织定位
        1.3 亚细胞定位
            1.3.1 烟草亚细胞定位
            1.3.2 洋葱表皮亚细胞定位
        1.4 水稻转基因材料构建
            1.4.1 水稻OE-CBSX3过表达株系构建
            1.4.2 水稻RNAi-CBSX3干扰株系构建
        1.5 野生型水稻的胁迫处理
            1.5.1 盐胁迫
            1.5.2 干旱胁迫
        1.6 OE-CBSX3过表达株系的盐处理
            1.6.1 盐处理
            1.6.2 过表达株系的定量分析
            1.6.3 Na⁺、K⁺测定
    2 结果分析
        2.1 组织定位
            2.1.1 OsCBSX3的组织表达模式
        2.2 亚细胞定位
            2.2.1 烟草亚细胞定位
            2.2.2 洋葱表皮亚细胞定位
        2.3 OsCBSX3对胁迫的响应
            2.3.1 OsCBSX3对盐胁迫的响应
            2.3.2 OsCBSX3对干旱胁迫的响应
        2.4 OE-CBSX3过表达株系的盐处理
            2.4.1 盐处理表型分析
            2.4.2 存活率
            2.4.3 盐处理前后Na⁺、K⁺含量
            2.4.4 过表达株系中OsCBSX3和OsRST1的表达量分析
    3 讨论
第四章 RST1互作蛋白Hsp40的定位及其耐盐功能分析
    引言
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 亚细胞定位
            1.2.1 载体构建
        1.3 OE-Hsp40过表达株系的盐处理
            1.3.1 荧光定量引物设计
            1.3.2 过表达载体构建
    2 结果分析
        2.1 亚细胞定位
            2.1.1 烟草亚细胞定位
            2.1.2 洋葱表皮亚细胞定位
        2.2 OsHsp40对胁迫的响应
            2.2.1 对盐胁迫的响应
            2.2.2 对干旱胁迫的响应
        2.3 OE-Hsp40过表达株系的盐处理
            2.3.1 盐处理表型
            2.3.2 存活率
            2.3.3 过表达株系中OsHsp40和OsRST1的表达量分析
    3 讨论
全文结论和创新之处
参考文献
附录Ⅰ
附录Ⅱ
致谢
学术成果目录



本文编号：3747206