太子参环肽B(Heterrophyllin B)前体蛋白基因的克隆与功能分析
发布时间：2023-02-26 09:44
目的:太子参环肽HB(HeterrophyllinB,HB)是太子参的指标性成分,具有抑制酪氨酸酶合成而减少皮肤中黑色素生成的药理作用。本研究旨在从太子参中筛选并克隆环肽HB的功能基因,并进行基因结构与功能验证,从基因水平研究太子参环肽HB物质的形成机制及探讨相关的影响因素提供理论依据。方法:1.运用生物信息学方法从太子参转录组数据库中获得多个环肽类Unigenes序列,通过同源克隆和RACE技术克隆太子参环肽HB前体蛋白基因;运用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和液质联用技术(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer,LC-MS)对环肽 HB 前体蛋白基因的体外酶促反应产物进行检测;构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,转基因植株运用PCR鉴定。2.采用HPLC法和(Real-Time Quantitative PCR,RT-qPCR)技术分别检测太子参中太子参环肽HB的含量和prePhHB基因的表达量,Excel软件分析相关性;通过PCR扩增与TA克隆研究太子参环肽HB...
【文章页数】：149 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
前言
第一章 太子参环肽前体蛋白基因的克隆与验证
第一节 太子参环肽前体蛋白基因的克隆与序列分析
1 实验材料
1.1植物材料
1.2 菌株与载体
1.3 酶与试剂
1.4 实验器材
2 实验方法
2.1 太子参环肽前体蛋白基因的鉴定
2.2 太子参总RNA提取纯化与质量检测
2.3 引物设计与合成
2.4 太子参环肽前体蛋白基因核心片段扩增
2.5 RACE技术扩增太子参prePhHB基因侧翼序列
2.6 太子参prePhHB基因序列分析
3 实验结果与分析
3.1 太子参环肽前体蛋白基因的鉴定
3.2 太子参RNA提取质量检测
3.3 太子参环肽前体蛋白基因核心片段扩增
3.4 太子参prePhHB基因侧翼扩增
3.5 太子参prePhHB基因序列分析
4 讨论
第二节 太子参prePhHB基因的结构验证
1 实验材料
1.1 植物材料
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 前体线性肽prePhHB设计与合成
2.2 绘制标准曲线
2.3 太子参粗酶提取
2.4 提取粗酶质量检测
2.5 prePhHB基因的结构验证
3 实验结果与分析
3.1 提取粗酶质量检测
3.2 太子参prePhHB体外酶促产物定量分析
3.3 太子参prePhHB体外酶促产物定性分析
4 讨论
第三节 太子参prePhHB基因在转基因烟草中表达验证
1 实验材料
1.1植物材料
1.2 菌株与载体
1.3 酶与试剂
1.4 引物设计与合成
2 实验方法
2.1 prePhHB基因植物表达载体构建
2.2 LBA4404-PLGNL-prePhHB转化菌液制备
2.3 prePhHB基因烟草转化
2.4 转基因烟草PCR鉴定
3 结果与分析
3.1 prePhHB基因植物表达载体构建与鉴定
3.2 prePhHB转基因烟草获得
3.3 prePhHB转基因烟草分子鉴定
4 讨论
第二章 不同种源太子参中环肽HB含量差异与太子参prePhHB基因的相关性研究
第一节 不同种源太子参中环肽HB含量分析
1 实验材料
1.1 实验样品
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 色谱条件
2.2 对照品溶液制备
2.3 供试品溶液制备
2.4 不同种源太子参中环肽I-HB含量测定
3 实验结果与分析
4 讨论
第二节 不同种源太子参中prePhHB基因表达分析
1 实验材料
1.1 供试材料
1.2 试剂与酶
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 太子参总RNA提取与合成cDNA第一链
2.2 引物设计与合成
2.3 cDNA第一链质量检测
2.4 引物质量检测
2.5 不同种源太子参prePhHB基因表达分析
2.6 不同种源太子参prePhHB表达量与太子参环肽HB含量的相关性分析
3 结果与分析
3.1 太子参总RNA质量检测
3.2 第一链cDNA质量检测
3.3 引物质量检测
3.4 实时荧光定量PCR反应灵敏性和特异性检测
3.5 不同种源太子参prePhHB基因表达分析
3.6 不同种源太子参prePhHB表达量与太子参环肽HB含量相关性分析
4 讨论
第三节 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的克隆分析
1 实验材料
1.1 供试材料
1.2 试剂与酶
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 太子参总RNA提取与质量检测
2.2 引物设计与合成
2.3 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的克隆
3 结果与分析
3.1 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的PCR扩增
3.2 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的克隆与测序
3.3 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的克隆序列分析
4 讨论
第三章 外源脱落酸和赤霉素对太子参prePhHB基因表达的影响
第一节 太子参中内源激素含量与prePhHB基因表达量相关性分析
1 实验材料
1.1 植物材料
1.2 实验仪器
1.3 试剂
2 实验方法
2.1 不同生长时期太子参中内源激素含量测定
2.2 不同生长时期太子参中prePhHB基因表达量检测
2.3 内源激素含量与prePhHB基因表达量相关性分析
3 结果与分析
3.1 ELISA检测标准曲线绘制
3.2 不同时期内源激素含量变化
3.3 太子参总RNA质量检测
3.4 第一链cDNA质量检测
3.5 prePhHB基因表达分析
3.6 内源激素含量与prePhH田基因表达量相关性
4 讨论
第二节 外源脱落酸与赤霉素对太子参中内源激素含量影响
1 实验材料
1.1 供试材料
1.2 实验仪器
1.3 实验试剂
2 实验方法
2.1 材料处理与取样
2.2 ELISA法检测原理
2.3 提取植物内源激素
2.4 ELISA法测定内源激素含量
2.5 结果计算与分析方法
3 结果与分析
3.1 ELISA检测绘制标准曲线
3.2 外源激素及其抑制剂处理后太子参中内源激素含量变化分析
4 讨论
第三节 外源脱落酸与赤霉素对太子参prePhHB基因表达影响
1 实验材料
1.1 植物材料
1.2 实验仪器
1.3 试剂与酶
2 实验方法
2.1 总RNA提取与质量检测
2.2 合成第一链cDNA
2.3 引物设计与合成
2.4 prePhHB基因表达分析
3 结果与分析
3.1 太子参总RNA质量检测
3.2 第一链cDNA质量检测
3.3 prePhHB基因表达分析
4 讨论
全文结论与展望
参考文献
附录一 综述
参考文献
附录二 太子参RNA提取质量检测
附录三 太子参环肽HB、PG核苷酸序列
附录四 不同种源太子参药材图片
附录五 阳性重组植物表达载体PLGNL-prePhHB测序图片
附录六 外源ABA、GA3处理太子参图片
附录七 不同生长时期太子参样品实时荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线
附录八 致谢
附录九 作者简介
本文编号：3750298
【文章页数】：149 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
前言
第一章 太子参环肽前体蛋白基因的克隆与验证
第一节 太子参环肽前体蛋白基因的克隆与序列分析
1 实验材料
1.1植物材料
1.2 菌株与载体
1.3 酶与试剂
1.4 实验器材
2 实验方法
2.1 太子参环肽前体蛋白基因的鉴定
2.2 太子参总RNA提取纯化与质量检测
2.3 引物设计与合成
2.4 太子参环肽前体蛋白基因核心片段扩增
2.5 RACE技术扩增太子参prePhHB基因侧翼序列
2.6 太子参prePhHB基因序列分析
3 实验结果与分析
3.1 太子参环肽前体蛋白基因的鉴定
3.2 太子参RNA提取质量检测
3.3 太子参环肽前体蛋白基因核心片段扩增
3.4 太子参prePhHB基因侧翼扩增
3.5 太子参prePhHB基因序列分析
4 讨论
第二节 太子参prePhHB基因的结构验证
1 实验材料
1.1 植物材料
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 前体线性肽prePhHB设计与合成
2.2 绘制标准曲线
2.3 太子参粗酶提取
2.4 提取粗酶质量检测
2.5 prePhHB基因的结构验证
3 实验结果与分析
3.1 提取粗酶质量检测
3.2 太子参prePhHB体外酶促产物定量分析
3.3 太子参prePhHB体外酶促产物定性分析
4 讨论
第三节 太子参prePhHB基因在转基因烟草中表达验证
1 实验材料
1.1植物材料
1.2 菌株与载体
1.3 酶与试剂
1.4 引物设计与合成
2 实验方法
2.1 prePhHB基因植物表达载体构建
2.2 LBA4404-PLGNL-prePhHB转化菌液制备
2.3 prePhHB基因烟草转化
2.4 转基因烟草PCR鉴定
3 结果与分析
3.1 prePhHB基因植物表达载体构建与鉴定
3.2 prePhHB转基因烟草获得
3.3 prePhHB转基因烟草分子鉴定
4 讨论
第二章 不同种源太子参中环肽HB含量差异与太子参prePhHB基因的相关性研究
第一节 不同种源太子参中环肽HB含量分析
1 实验材料
1.1 实验样品
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 色谱条件
2.2 对照品溶液制备
2.3 供试品溶液制备
2.4 不同种源太子参中环肽I-HB含量测定
3 实验结果与分析
4 讨论
第二节 不同种源太子参中prePhHB基因表达分析
1 实验材料
1.1 供试材料
1.2 试剂与酶
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 太子参总RNA提取与合成cDNA第一链
2.2 引物设计与合成
2.3 cDNA第一链质量检测
2.4 引物质量检测
2.5 不同种源太子参prePhHB基因表达分析
2.6 不同种源太子参prePhHB表达量与太子参环肽HB含量的相关性分析
3 结果与分析
3.1 太子参总RNA质量检测
3.2 第一链cDNA质量检测
3.3 引物质量检测
3.4 实时荧光定量PCR反应灵敏性和特异性检测
3.5 不同种源太子参prePhHB基因表达分析
3.6 不同种源太子参prePhHB表达量与太子参环肽HB含量相关性分析
4 讨论
第三节 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的克隆分析
1 实验材料
1.1 供试材料
1.2 试剂与酶
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 太子参总RNA提取与质量检测
2.2 引物设计与合成
2.3 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的克隆
3 结果与分析
3.1 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的PCR扩增
3.2 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的克隆与测序
3.3 不同种源太子参prePhHB基因表达差异的克隆序列分析
4 讨论
第三章 外源脱落酸和赤霉素对太子参prePhHB基因表达的影响
第一节 太子参中内源激素含量与prePhHB基因表达量相关性分析
1 实验材料
1.1 植物材料
1.2 实验仪器
1.3 试剂
2 实验方法
2.1 不同生长时期太子参中内源激素含量测定
2.2 不同生长时期太子参中prePhHB基因表达量检测
2.3 内源激素含量与prePhHB基因表达量相关性分析
3 结果与分析
3.1 ELISA检测标准曲线绘制
3.2 不同时期内源激素含量变化
3.3 太子参总RNA质量检测
3.4 第一链cDNA质量检测
3.5 prePhHB基因表达分析
3.6 内源激素含量与prePhH田基因表达量相关性
4 讨论
第二节 外源脱落酸与赤霉素对太子参中内源激素含量影响
1 实验材料
1.1 供试材料
1.2 实验仪器
1.3 实验试剂
2 实验方法
2.1 材料处理与取样
2.2 ELISA法检测原理
2.3 提取植物内源激素
2.4 ELISA法测定内源激素含量
2.5 结果计算与分析方法
3 结果与分析
3.1 ELISA检测绘制标准曲线
3.2 外源激素及其抑制剂处理后太子参中内源激素含量变化分析
4 讨论
第三节 外源脱落酸与赤霉素对太子参prePhHB基因表达影响
1 实验材料
1.1 植物材料
1.2 实验仪器
1.3 试剂与酶
2 实验方法
2.1 总RNA提取与质量检测
2.2 合成第一链cDNA
2.3 引物设计与合成
2.4 prePhHB基因表达分析
3 结果与分析
3.1 太子参总RNA质量检测
3.2 第一链cDNA质量检测
3.3 prePhHB基因表达分析
4 讨论
全文结论与展望
参考文献
附录一 综述
参考文献
附录二 太子参RNA提取质量检测
附录三 太子参环肽HB、PG核苷酸序列
附录四 不同种源太子参药材图片
附录五 阳性重组植物表达载体PLGNL-prePhHB测序图片
附录六 外源ABA、GA3处理太子参图片
附录七 不同生长时期太子参样品实时荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线
附录八 致谢
附录九 作者简介
本文编号：3750298
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