三分三WRKY转录因子AaWRKY23的克隆及功能初探
发布时间：2023-03-11 00:00
三分三(Anisodus acutangulus)是我国云南特有的茄科山莨菪属的多年生草本植物,由于能够产生托品烷生物碱而被广泛关注。三分三中生物碱的总含量达到1.2%,比世界上其它一些茄科植物如天仙子(Hyoscyamus niger),颠茄(Atropa belladonna),曼陀罗(Datura Stramonium)等中的含量都要高的多,是开发和利用生物碱的不可多得的一种植物资源,因此作为药用植物它具有重要的研究意义和应用价值。托品烷类生物碱是一类来自茄科植物的次生代谢产物主要包括莨菪碱(Hyoscyamine)、山莨菪碱(Anisodamine)、樟柳碱(Anisodine)和东莨菪碱(Scopolamine)。它是一类具有巨大药用价值的抗胆碱药物,主要作用于副交感神经系统,具有镇痛、止咳、麻醉,抗晕动症等作用,其中莨菪碱和东莨菪碱被广泛应用于临床治疗,市场需求十分巨大。因此利用基因工程手段提高三分三中莨菪碱和东莨菪碱的产量,将有效缓解市场紧张的供求矛盾。本论文以三分三为材料,运用分子生物学手段,首次从三分三中克隆了一条WRKY转录因子AaWRKY23。分析了该转录因子的生...
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写词表
第一章 文献综述
1.1 三分三简介
1.2 生物碱概述
1.3 托品烷生物碱概述
1.3.1 莨菪碱（Hyoscyamine）
1.3.2 东莨菪碱（Hyoscyamine）
1.3.3 山莨菪碱（Anisodamine）
1.3.4 樟柳碱（Anisodine）
1.4 托品烷生物碱的合成方式
1.5 托品烷生物碱的合成途径
1.5.1 腐胺N-甲基转移酶(PMT)
1.5.2 托品酮还原酶I(TRI)和托品酮还原酶II(TRII)
1.5.3 莨菪碱6-β羟化酶(H6H)
1.6 提高托品烷生物碱含量的方法
1.6.1 单基因或多基因共转化策略
1.6.2 转录因子调控策略
1.6.3 反义或RNAi干扰策略
1.6.4 诱导策略
1.7 WRKY转录因子
1.7.1 WRKY转录因子概述
1.7.2 WRKY转录因子的结构特点
1.7.3 WRKY转录因子的生物学功能
1.8 本课题的研究目的和研究意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体与菌种
2.1.3 主要的仪器设备
2.1.4 常用的试剂
2.2 实验方法
2.2.1 三分三无菌苗的快繁
2.2.2 三分三WRKY转录因子的筛选
2.2.3 AaWRKYs的进化树分析、序列对比、分组和保守结构域的识别
2.2.4 组织表达谱分析
2.2.5 AaWRKY23基因的克隆
2.2.6 AaWRKY23的亚细胞定位
2.2.7 植物表达载体的构建
2.2.8 农杆菌C58C1介导的遗传转化
2.2.9 AaWRKY23转基因毛状根的阳性鉴定
2.2.10 三分三转基因毛状根阳性克隆的qRT-PCR分析
2.2.11 AaWRKY23转基因三分三毛状根有效成分的检测
2.2.12 酵母单杂交实验
2.2.13 Dual-Luc实验
第三章 结果与讨论
3.1 目的基因的筛选
3.1.1 AaWRKYs的命名和分类
3.1.2 AaWRKYs的多重序列比对以及保守结构域的识别
3.1.3 托品烷生物碱合成途径中关键酶基因的组织表达谱分析
3.1.4 AaWRKYs的组织表达谱分析
3.1.5 AaWRKYs与其它WRKYs的系统进化树分析
3.2 AaWRKY23基因的克隆
3.3 AaWRKY23的生物信息学分析
3.3.1 AaWRKY23的进化树分析
3.3.2 AaWRKY23的多重序列比对
3.3.3 AaWRKY23的蛋白质高级结构预测
3.4 AaWRKY23的亚细胞定位分析
3.4.1 载体pHB::AaWRKY23-YFP的构建
3.4.2 亚细胞定位结果分析
3.5 植物表达载体的构建
3.5.1 过表达载体pHB::AaWRKY23-YFP的构建
3.6 农杆菌C58C1介导的三分三外植体的遗传转化
3.7 三分三转基因毛状根的PCR阳性鉴定
3.7.1 pHB-YFP空载转基因毛状根的PCR阳性鉴定
3.7.2 pHB::AaWRKY23-YFP过表达转基因毛状根的PCR阳性鉴定
3.8 AaWRKY23转基因毛状根的qRT-PCR分析以及HPLC含量测定
3.8.1 AaWRKY23过表达转基因毛状根的筛选
3.8.2 AaWRKY23过表达转基因毛状根株系中TAs生物合成途径中关键酶基因的定量PCR分析
3.8.3 AaWRKY23过表达转基因毛状根中托品烷生物碱含量测定
3.9 酵母单杂实验
3.9.1 placz2u表达载体构建
3.9.2 pB42AD载体的构建
3.9.3 酵母单杂实验
3.10 Dual-Luc实验
3.10.1 pGreen0800载体的构建
3.10.2 Dual-Luc实验结果分析
第四章 研究总结与展望
4.1 研究总结
4.2 研究展望
参考文献
论文及成果
致谢
附件
本文编号：3758807
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写词表
第一章 文献综述
1.1 三分三简介
1.2 生物碱概述
1.3 托品烷生物碱概述
1.3.1 莨菪碱（Hyoscyamine）
1.3.2 东莨菪碱（Hyoscyamine）
1.3.3 山莨菪碱（Anisodamine）
1.3.4 樟柳碱（Anisodine）
1.4 托品烷生物碱的合成方式
1.5 托品烷生物碱的合成途径
1.5.1 腐胺N-甲基转移酶(PMT)
1.5.2 托品酮还原酶I(TRI)和托品酮还原酶II(TRII)
1.5.3 莨菪碱6-β羟化酶(H6H)
1.6 提高托品烷生物碱含量的方法
1.6.1 单基因或多基因共转化策略
1.6.2 转录因子调控策略
1.6.3 反义或RNAi干扰策略
1.6.4 诱导策略
1.7 WRKY转录因子
1.7.1 WRKY转录因子概述
1.7.2 WRKY转录因子的结构特点
1.7.3 WRKY转录因子的生物学功能
1.8 本课题的研究目的和研究意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体与菌种
2.1.3 主要的仪器设备
2.1.4 常用的试剂
2.2 实验方法
2.2.1 三分三无菌苗的快繁
2.2.2 三分三WRKY转录因子的筛选
2.2.3 AaWRKYs的进化树分析、序列对比、分组和保守结构域的识别
2.2.4 组织表达谱分析
2.2.5 AaWRKY23基因的克隆
2.2.6 AaWRKY23的亚细胞定位
2.2.7 植物表达载体的构建
2.2.8 农杆菌C58C1介导的遗传转化
2.2.9 AaWRKY23转基因毛状根的阳性鉴定
2.2.10 三分三转基因毛状根阳性克隆的qRT-PCR分析
2.2.11 AaWRKY23转基因三分三毛状根有效成分的检测
2.2.12 酵母单杂交实验
2.2.13 Dual-Luc实验
第三章 结果与讨论
3.1 目的基因的筛选
3.1.1 AaWRKYs的命名和分类
3.1.2 AaWRKYs的多重序列比对以及保守结构域的识别
3.1.3 托品烷生物碱合成途径中关键酶基因的组织表达谱分析
3.1.4 AaWRKYs的组织表达谱分析
3.1.5 AaWRKYs与其它WRKYs的系统进化树分析
3.2 AaWRKY23基因的克隆
3.3 AaWRKY23的生物信息学分析
3.3.1 AaWRKY23的进化树分析
3.3.2 AaWRKY23的多重序列比对
3.3.3 AaWRKY23的蛋白质高级结构预测
3.4 AaWRKY23的亚细胞定位分析
3.4.1 载体pHB::AaWRKY23-YFP的构建
3.4.2 亚细胞定位结果分析
3.5 植物表达载体的构建
3.5.1 过表达载体pHB::AaWRKY23-YFP的构建
3.6 农杆菌C58C1介导的三分三外植体的遗传转化
3.7 三分三转基因毛状根的PCR阳性鉴定
3.7.1 pHB-YFP空载转基因毛状根的PCR阳性鉴定
3.7.2 pHB::AaWRKY23-YFP过表达转基因毛状根的PCR阳性鉴定
3.8 AaWRKY23转基因毛状根的qRT-PCR分析以及HPLC含量测定
3.8.1 AaWRKY23过表达转基因毛状根的筛选
3.8.2 AaWRKY23过表达转基因毛状根株系中TAs生物合成途径中关键酶基因的定量PCR分析
3.8.3 AaWRKY23过表达转基因毛状根中托品烷生物碱含量测定
3.9 酵母单杂实验
3.9.1 placz2u表达载体构建
3.9.2 pB42AD载体的构建
3.9.3 酵母单杂实验
3.10 Dual-Luc实验
3.10.1 pGreen0800载体的构建
3.10.2 Dual-Luc实验结果分析
第四章 研究总结与展望
4.1 研究总结
4.2 研究展望
参考文献
论文及成果
致谢
附件
本文编号：3758807
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