ChIFN-γ调控烟草腺毛发育关键基因功能的研究

发布时间：2023-03-12 20:00

　　鸡γ干扰素(Chicken interferon-gamma,ChIFN-γ)是一类具有抗病毒活性、抗细菌与抗寄生虫的作用的细胞因子。实验室前期发现转ChIFN-γ烟草的腺毛密度增加,腺毛分泌物明显增多,抗虫性提高。通过全基因组表达谱芯片结合生物信息学分析,推测一条信号通路上的3个关键基因(CyP71、LBM1和IspH)与烟草腺毛发育相关性显著。在IspH功能研究的基础上,以剩余2个基因的功能进行研究,并通过原核表达纯化目的蛋白、应用等温量热技术(ITC)研究ChIFN-γ与3个蛋白的互作,研究结果如下:(1)构建含植物过表达载体pSH737-CyP71和pSH737-LBM1的农杆菌LBA4404,通过蘸花法遗传转化拟南芥,收集种子进行抗性筛选,分别获得到抗性植株50株和65株,基因组PCR呈阳性。GUS染色及表皮细胞显微观察显示,转CyP71拟南芥GUS染色叶片群不呈现深蓝色,数量显著增加100%;转LBM1拟南芥GUS染色,表皮毛细胞均呈蓝色,数量显著增加100%,LBM1基因的表达与拟南芥表皮毛的发育呈正相关。(2)将ChIFN-γ、IspH构建到原核表达载体获得pET28a...

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
    1.1 干扰素的研究进展
    1.2 ChIFN-γ的研究进展
    1.3 烟草腺毛的研究进展
        1.3.1 烟草腺毛的形态学特征
        1.3.2 烟草腺毛的结构与类型
        1.3.3 调控烟草腺毛发育相关基因的研究进展
    1.4 调控拟南芥的表皮毛发育特异性表达的基因
    1.5 研究蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法
        1.5.1 酵母双杂交系统
        1.5.2 等温滴定量热法
        1.5.3 表面等离子共振技术
        1.5.4 免疫共沉淀技术
        1.5.5 GST-pull-down技术
    1.6 本研究的目的及意义
第二章 拟南芥的遗传与转化
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 菌种和植物材料
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 实验仪器
        2.2.4 染色液和培养基的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 拟南芥的培养
        2.3.2 拟南芥的遗传转化
        2.3.3 拟南芥T1代转基因种子的筛选
        2.3.4 拟南芥基因组的提取
        2.3.5 抗性植株PCR检测
        2.3.6 GUS组织化学染色检测抗性植株
    2.4 结果与分析
        2.4.1 抗性植株的筛选与鉴定
        2.4.2 转基因拟南芥性状的观察
    2.5 讨论
第三章 ChIFN-γ与IspH、CyP71和LBM1的蛋白互作
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 细菌与质粒
        3.2.2 主要实验仪器
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 试剂盒
        3.2.5 酶切引物的设计
        3.2.6 试剂的配置
    3.3 实验方法
        3.3.1 目的DNA片段的扩增
        3.3.2 PCR产物的检测与胶回收
        3.3.3 目的基因质粒的提取
        3.3.4 质粒PCR检测目的基因及胶回收
        3.3.5 pET28a、pET30a质粒的提取
        3.3.6 pET28a、pET30a质粒的双酶切及回收
        3.3.7 ChIFN-γ、IspH、CyP71和LBM1的双酶切及其产物回收
        3.3.8 目的基因Ch IFN-γ、IspH、Cy P71、LBM1和表达载体的连接
        3.3.9 感受态大肠杆菌（E.coli BL(21)）的制备
        3.3.10 连接产物的转化
        3.3.11 重组质粒的鉴定
        3.3.12 重组质粒的测序
        3.3.13 重组蛋白的小量诱导表达
        3.3.14 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达
        3.3.15 重组蛋白的大量诱导表达
        3.3.16 重组蛋白的纯化
        3.3.17 目的蛋白的复性透析
        3.3.18 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
        3.3.19 Western Blot检测ChIFN-γ、IspH、CyP71、LBM1蛋白
        3.3.20 等温滴定量热法检测蛋白间的相互作用
    3.4 实验结果与分析
        3.4.1 ChIFN-γ、Isp H、CyP71和LBM1基因PCR扩增
        3.4.2 菌落PCR检测重组表达载体
        3.4.3 质粒PCR检测重组质粒
        3.4.4 双酶切鉴定重组质粒
        3.4.5 重组蛋白小量诱导表达
        3.4.6 重组蛋白的大量诱导表达
        3.4.7 离子交换层析纯化ChIFN-γ和IspH蛋白
        3.4.8 亲和层析纯化CyP71和LBM1蛋白
        3.4.9 纯化蛋白的浓度测定
        3.4.10 Western Blot检测ChIFN-γ、IspH、CyP71和LBM1蛋白
        3.4.11 等温滴定量热仪检测蛋白互作
    3.5 讨论
第四章 总结与展望
    4.1 总结
    4.2 展望
参考文献
附录
致谢
在读期间参与科研项目
在读期间发表文章



本文编号：3761858