中国被毛孢高产核苷菌株的选育及关键酶表达分析

发布时间：2023-03-19 21:27

　　冬虫夏草是虫草真菌寄生于蝙蝠蛾幼虫而生成的子座与虫体的虫菌复合体,中国被毛孢(Hirsutella sinensis)是公认的冬虫夏草无性型真菌,其功能和成分与冬虫夏草高度相似,已成为野生冬虫夏草的替代品。核苷作为中国被毛孢产品的一个重要指标,其对于提高产品质量和增强市场竞争力至关重要。本文针对中国被毛孢首次研究其原生质体制备与再生,建立了原生质体常压室温等离子(ARTP)与甲基磺酸乙酯(EMS)复合诱变技术,获得核苷高产菌株,并探究了核苷代谢途径中关键酶的基因表达差异。本文首先对中国被毛孢菌株Hirsutella sinensis ZJB18002原生质体的制备与再生方法进行优化,考察了渗透压稳定剂种类及浓度、裂解酶种类及浓度、酶解温度、酶解时间和培养时间等因素对原生质体制备的影响,获得了最适的原生质体制备条件:将培养7 d的中国被毛孢菌丝体悬浮于5 m L含0.6 mol/L KCl和3mg/m L破壁酶、4 mg/m L溶壁酶和3 mg/m L崩溃酶的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(p H=5.5)中,于18℃,120 rpm酶解0.5 h,原生质体产量达4.37×10^...

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 冬虫夏草菌中国被毛孢研究进展
    1.3 原生质体技术研究进展
    1.4 菌株选育
        1.4.1 ARTP诱变
        1.4.2 EMS诱变
        1.4.3 复合诱变
    1.5 中国被毛孢代谢途径
        1.5.1 中国被毛孢代谢途径研究进展
        1.5.2 核苷代谢途径
    1.6 本课题的选题背景与意义
        1.6.1 立题背景和意义
        1.6.2 本文主要研究内容
第二章 中国被毛孢原生质体的制备与再生
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌株
        2.2.2 仪器与设备
        2.2.3 主要药品与试剂
        2.2.4 培养基及溶液的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 中国被毛孢ZJB18002的培养
        2.3.2 中国被毛孢ZJB18002原生质体制备
        2.3.3 原生质体形成过程及活力检测
        2.3.4 原生质体再生
        2.3.5 统计分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 中国被毛孢ZJB18002原生质体制备影响因素
        2.4.2 原生质体形成过程及活力的检测
        2.4.3 中国被毛孢ZJB18002原生质体再生影响因素
    2.5 本章小结
第三章 中国被毛孢Hirsrtella sinensis ZJB18002 原生质体的诱变
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 出发菌株
        3.2.2 仪器与设备
        3.2.3 主要药品与试剂
        3.2.4 培养基与溶液的配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 分析方法
        3.3.2 原生质体的制备
        3.3.3 ARTP诱变
        3.3.4 EMS诱变
        3.3.6 突变株的生理生化鉴定
        3.3.7 突变株的遗传学鉴定
        3.3.8 统计分析
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 中国被毛孢 Hirsrtella sinensis ZJB18002 深层发酵曲线
        3.4.2 ARTP诱变
        3.4.3 EMS诱变
        3.4.4 复合诱变突变株稳定性实验
        3.4.5 突变株的生理生化和遗传学鉴定
    3.5 本章小结
第四章 突变菌株核苷代谢途径中关键酶的差异表达分析
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验菌株
        4.2.2 仪器与设备
        4.2.3 主要药品与试剂
        4.2.4 培养基与溶液的配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 总RNA提取
        4.3.2 RNA质量检测
        4.3.3 RNA反转录获得c DNA
        4.3.4 关键酶基因验证
        4.3.5 实时荧光定量PCR
        4.3.6 实验数据分析
        4.3.7 统计分析
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 RNA的提取及质量检测结果
        4.4.2 关键酶基因的挖掘
        4.4.3 关键酶基因的异源表达
        4.4.4 核苷代谢途径中关键酶基因表达分析
    4.5 本章小结
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
作者简介
    1 作者简历
    2 攻读硕士学位期间发表的学术论文
    3 发明专利
学位论文数据集



本文编号：3766013