水稻蛋白糖基化类型及植物特异性糖苷的免疫原性研究
发布时间：2023-04-11 01:08
植物蛋白的特异性糖苷修饰一直被怀疑具有潜在的免疫原性,进入人体后可能具有安全性风险,因而限制了它的进一步应用。但这些数据均来自于叶片而不是种子,对种子蛋白的糖苷类型的研究非常有限,而关于其免疫原性的报道则基本没有。水稻胚乳是一种经济有效的生物反应器,因此,研究种子和叶片的糖苷类型差异以及植物特异性糖苷的免疫原性,对水稻胚乳细胞生物反应器的应用具有重要意义。在本研究中,为了探讨水稻胚乳细胞蛋白的糖苷修饰与叶片蛋白修饰间的差异以及植物特异性糖苷的免疫原性,我们首先获得了水稻胚乳特异性表达的人α-1,6-岩藻糖转移酶(FUT8)基因和β-1,4-半乳糖转移酶(GalT)基因水稻品系。为了加快育种进程,我们优化了一种利用水稻基因RBE4作为内参的定量PCR法,用于快速准确地筛选纯合子单株和鉴定转基因的拷贝数。通过杂交,把FUT8、GalT和hAAT(人α抗胰蛋白酶)这三个基因聚合起来,获得了部分人源化糖苷修饰的AAT转基因水稻品系,然后比较了不同糖苷修饰的AAT的糖基化结构,并对其免疫原性做出评价。主要研究结果如下:1.通过MALDI-TOF MS分析,我们发现水稻叶片和种子蛋白的糖苷修饰存在...
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
第一节 生物制药的发展及现状
第二节 生物制药的种类
1.2.1 抗体类药物
1.2.2 重组蛋白类药物
1.2.3 疫苗
1.2.4 细胞因子
1.2.5 其他
第三节 用于生物制药的各种表达体系
1.3.1 微生物生物反应器
1.3.2 动物生物反应器
1.3.3 植物生物反应器
1.3.3.1 植物生物反应器的宿主研究进展
1.3.3.2 不同类型植物生物反应器的研究进展
第四节 糖蛋白的N-糖基化修饰的研究进展
1.4.1 N-糖基化修饰的功能及特点
1.4.1.1 N-糖基化修饰对蛋白结构和功能的影响
1.4.1.2 N-糖基化修饰的不均一性
1.4.1.3 N-糖基化修饰对生物蛋白药物功能的重要作用
1.4.2 不同表达体系中N-糖基化修饰的差异
1.4.2.1 动物和植物中N-糖基化修饰的不同
1.4.2.2 不同物种间N-糖基化修饰的差异
1.4.2.3 不同器官和组织间N-糖基化修饰的差异
1.4.2.4 不同细胞器中N-糖基化修饰的差异
1.4.2.5 不同生长周期中N-糖基化修饰的不同
1.4.3 植物特异性N-糖基化修饰的免疫原性
第五节 植物细胞人源化N-糖基化修饰的研究进展
第二章 水稻不同品种及不同组织的糖基化修饰
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
2.2.1 供试材料品种
2.2.2 总蛋白提取
2.2.3 糖苷的分离与纯化
2.2.4 MALDI-TOF MS
第三节 实验结果
2.3.1 水稻不同品种种子蛋白的N-糖基化修饰分析
2.3.2 水稻不同品种叶片的N-糖基化修饰研究
2.3.3 水稻种子和叶片蛋白的N-糖基化修饰类型比较
2.3.4 水稻种子和叶片中N-连接糖苷定量分析
第四节 小结和讨论
第三章 水稻胚乳中人源化糖苷修饰研究
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
3.2.1 载体构建和水稻转化
3.2.2 水稻种子的总蛋白提取
3.2.3 水稻种子储藏谷蛋白提取
3.2.4 Western blotting分析
3.2.5 转基因单株的纯合子筛选
3.2.6 水稻胚乳储藏谷蛋白的糖基化结构分析
3.2.7 α-1,6-岩藻糖含量的定量分析
3.2.8 转基因的聚合
第三节 实验结果
3.3.1 过量表达FUT8和GalT基因的转基因植株的获得
3.3.2 转基因水稻种子中谷蛋白的N-连接糖苷结构分析
第四节 小结和讨论
第四章 不同糖苷修饰背景下人α抗胰蛋白酶的糖基化修饰分析
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 纯合子筛选
4.2.3 Western blotting分析
4.2.4 重组AAT的纯化
4.2.5 重组AAT糖基结构分析
第三节 实验结果
4.3.1 表达人源化糖苷修饰的AAT转基因品系选育
4.3.2 重组AAT的纯化与分析
4.3.3 OsrAAT和mgOsrAAT的N-糖基化结构分析
第四节 小结和讨论
第五章 OsrAAT和mgOsrAAT免疫原性的比较
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 家兔免疫
5.2.2.1 样品配置
5.2.2.2 实验分组
5.2.2.3 给药方法
5.2.2.4 样本采集及处理
5.2.2.5 一般临床观察
5.2.2.6 血清中抗体效价测定
5.2.2.7 血清中AAT特异IgG、IgM和IgE的测定
5.2.3 被动致敏实验
5.2.3.1 动物分组
5.2.3.2 致敏
5.2.3.3 激发
5.2.3.4 结果判定
5.2.4 血清中植物特异性糖苷的抗体浓度检测
第三节 实验结果
5.3.1 一般临床观察
5.3.2 不同来源AAT的抗体效价分析
5.3.3 血清中抗AAT的IgG、IgM和IgE含量分析
5.3.4 豚鼠皮肤被动过敏
5.3.5 血清中植物特异性α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖的抗体浓度
第四节 小结和讨论
附 一种快速鉴定转基因纯合子及拷贝数的方法
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
2.1 供本实验的转基因品系
2.2 基因组DNA提取
2.3 PCR扩增和引物
2.4 SYBR Green定量PCR
2.5 转基因纯合子的鉴定
2.6 纯合子植株的PCR验证
2.7 转基因拷贝数的确定
2.8 Southern杂交分析
第三节 实验结果
3.1 用于纯合子鉴定的内参基因的选择
3.2 利用Ct值(2-△△Ct)鉴定转基因植株的纯合子和杂合子
3.3 在T2代中验证已检测出的纯合子的准确性
3.4 用于确定插入位点数及验证
第四节 小结和讨论
参考文献
在读期间发表的文章及专利
专利及奖励
致谢
本文编号：3789053
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
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摘要
Abstract
第一章 绪论
第一节 生物制药的发展及现状
第二节 生物制药的种类
1.2.1 抗体类药物
1.2.2 重组蛋白类药物
1.2.3 疫苗
1.2.4 细胞因子
1.2.5 其他
第三节 用于生物制药的各种表达体系
1.3.1 微生物生物反应器
1.3.2 动物生物反应器
1.3.3 植物生物反应器
1.3.3.1 植物生物反应器的宿主研究进展
1.3.3.2 不同类型植物生物反应器的研究进展
第四节 糖蛋白的N-糖基化修饰的研究进展
1.4.1 N-糖基化修饰的功能及特点
1.4.1.1 N-糖基化修饰对蛋白结构和功能的影响
1.4.1.2 N-糖基化修饰的不均一性
1.4.1.3 N-糖基化修饰对生物蛋白药物功能的重要作用
1.4.2 不同表达体系中N-糖基化修饰的差异
1.4.2.1 动物和植物中N-糖基化修饰的不同
1.4.2.2 不同物种间N-糖基化修饰的差异
1.4.2.3 不同器官和组织间N-糖基化修饰的差异
1.4.2.4 不同细胞器中N-糖基化修饰的差异
1.4.2.5 不同生长周期中N-糖基化修饰的不同
1.4.3 植物特异性N-糖基化修饰的免疫原性
第五节 植物细胞人源化N-糖基化修饰的研究进展
第二章 水稻不同品种及不同组织的糖基化修饰
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
2.2.1 供试材料品种
2.2.2 总蛋白提取
2.2.3 糖苷的分离与纯化
2.2.4 MALDI-TOF MS
第三节 实验结果
2.3.1 水稻不同品种种子蛋白的N-糖基化修饰分析
2.3.2 水稻不同品种叶片的N-糖基化修饰研究
2.3.3 水稻种子和叶片蛋白的N-糖基化修饰类型比较
2.3.4 水稻种子和叶片中N-连接糖苷定量分析
第四节 小结和讨论
第三章 水稻胚乳中人源化糖苷修饰研究
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
3.2.1 载体构建和水稻转化
3.2.2 水稻种子的总蛋白提取
3.2.3 水稻种子储藏谷蛋白提取
3.2.4 Western blotting分析
3.2.5 转基因单株的纯合子筛选
3.2.6 水稻胚乳储藏谷蛋白的糖基化结构分析
3.2.7 α-1,6-岩藻糖含量的定量分析
3.2.8 转基因的聚合
第三节 实验结果
3.3.1 过量表达FUT8和GalT基因的转基因植株的获得
3.3.2 转基因水稻种子中谷蛋白的N-连接糖苷结构分析
第四节 小结和讨论
第四章 不同糖苷修饰背景下人α抗胰蛋白酶的糖基化修饰分析
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 纯合子筛选
4.2.3 Western blotting分析
4.2.4 重组AAT的纯化
4.2.5 重组AAT糖基结构分析
第三节 实验结果
4.3.1 表达人源化糖苷修饰的AAT转基因品系选育
4.3.2 重组AAT的纯化与分析
4.3.3 OsrAAT和mgOsrAAT的N-糖基化结构分析
第四节 小结和讨论
第五章 OsrAAT和mgOsrAAT免疫原性的比较
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 家兔免疫
5.2.2.1 样品配置
5.2.2.2 实验分组
5.2.2.3 给药方法
5.2.2.4 样本采集及处理
5.2.2.5 一般临床观察
5.2.2.6 血清中抗体效价测定
5.2.2.7 血清中AAT特异IgG、IgM和IgE的测定
5.2.3 被动致敏实验
5.2.3.1 动物分组
5.2.3.2 致敏
5.2.3.3 激发
5.2.3.4 结果判定
5.2.4 血清中植物特异性糖苷的抗体浓度检测
第三节 实验结果
5.3.1 一般临床观察
5.3.2 不同来源AAT的抗体效价分析
5.3.3 血清中抗AAT的IgG、IgM和IgE含量分析
5.3.4 豚鼠皮肤被动过敏
5.3.5 血清中植物特异性α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖的抗体浓度
第四节 小结和讨论
附 一种快速鉴定转基因纯合子及拷贝数的方法
第一节 前言
第二节 实验材料和方法
2.1 供本实验的转基因品系
2.2 基因组DNA提取
2.3 PCR扩增和引物
2.4 SYBR Green定量PCR
2.5 转基因纯合子的鉴定
2.6 纯合子植株的PCR验证
2.7 转基因拷贝数的确定
2.8 Southern杂交分析
第三节 实验结果
3.1 用于纯合子鉴定的内参基因的选择
3.2 利用Ct值(2-△△Ct)鉴定转基因植株的纯合子和杂合子
3.3 在T2代中验证已检测出的纯合子的准确性
3.4 用于确定插入位点数及验证
第四节 小结和讨论
参考文献
在读期间发表的文章及专利
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致谢
本文编号：3789053
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