基于烟草转录组的SNP标记开发及其初步应用

发布时间：2023-05-27 05:58

　　烟草(Nicotiana tabacum L.)是我国重要的经济作物之一,但我国烟草育种面临亲本匮乏、品种遗传背景狭窄、盲目性、重复性大等问题。SNP标记被广泛应用于作物种质资源的亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、分子标记辅助选择等方面。高通量转录组测序为SNP标记的开发提供了大量信息,但在烟草中的应用鲜有报道。因此,本研究基于烟草转录组测序获得的大量unigenes,利用生物信息学方法鉴定出大量SNPs,进而根据SNP位点信息开发AS-PCR和KASP标记,并应用于烟草种质遗传多样性分析和种质的指纹图谱构建。具体研究结果如下:1.采用高通量Illumina HiSeqTM对10个烟草材料进行转录组测序,共获得108.04G Clean bases,平均每个样本10.084G。将reads比对到参考基因组上进行SNP calling,共获得SNP位点121416个。其中,转换型SNP有78236个,占比64.4%,颠换型SNP有42842,占比35.3%,二者之比为1.83:1。转换型中,C->T略多,而G->T在颠换型中占多数。2.采用AS-PCR、ARMS-PCR和KASP三...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 DNA分子标记技术的种类及其特点
        1.1.1 第一代DNA分子标记
            1.1.1.1 限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)
            1.1.1.2 随机扩增DNA多态性(RAPD)
            1.1.1.3 扩增片段长度多态性(AFLP)
        1.1.2 第二代DNA分子标记
            1.1.2.1 简单重复序列(SSR)标记
            1.1.2.2 简单重复序列区间(ISSR)标记
        1.1.3 第三代DNA分子标记
    1.2 SNP的发掘技术
        1.2.1 基于公共数据库中的EST序列开发SNP
        1.2.2 基于基因组序列开发SNP
        1.2.3 基于第二代高通量测序技术开发SNP
        1.2.4 基于Genotyping-by-sequencing(GBS)开发SNP
    1.3 SNP的检测方法及原理
        1.3.1 基于凝胶电泳的检测方法
            1.3.1.1 单链构象多态性(SSCP)
            1.3.1.2 酶切扩增多态性序列(CAPS)
            1.3.1.3 等位基因特异性PCR(AS-PCR)
        1.3.2 基于高通量、自动化的检测方法
            1.3.2.1 直接测序
            1.3.2.2 基因芯片
            1.3.2.3 变性高效液相色谱(DHPLC)
            1.3.2.4 质谱检测
            1.3.2.5 高分辨熔解曲线(HRM)
            1.3.2.6 KASP技术
    1.4 SNP标记在作物遗传育种中的应用
        1.4.1 高密度遗传图谱的构建
        1.4.2 重要性状的基因定位
        1.4.3 品种鉴定及种质资源管理
    1.5 烟草DNA分子标记研究现状
    1.6 本研究的目的及意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 设备与仪器
    2.2 方法
        2.2.1 烟草转录组测序
        2.2.2 SNP位点筛选
        2.2.3 SNP引物设计
            2.2.3.1 等位基因特异性PCR(AS-PCR)引物
            2.2.3.2 四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)引物
            2.2.3.3 竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)引物
        2.2.4 DNA提取及检测
        2.2.5 AS-PCR扩增条件的优化
        2.2.6 SNP检测方法的选择
        2.2.7 SNP扩增产物的基因分型
        2.2.8 烟草种质的遗传多样性分析
        2.2.9 DNA指纹图谱构建
3 结果与分析
    3.1 基于转录组测序的SNP分析
    3.2 DNA浓度、纯度及质量检测
    3.3 AS-PCR扩增条件的优化
        3.3.1 退火温度的优化
        3.3.2 反应体系的优化
        3.3.3 反应程序的优化
    3.4 烟草SNP标记检测方法的选择
        3.4.1 AS-PCR、Tetra-primer ARMS-PCR和 KASP对位点S350 的检测效果
        3.4.2 AS-PCR、Tetra-primer ARMS-PCR和 KASP对位点S382 的检测效果
    3.5 多态性SNP引物筛选
    3.6 SNP扩增产物的基因分型
        3.6.1 AS-PCR检测方法的SNP分型
        3.6.2 KASP检测方法的SNP分型
    3.7 SNP位点序列的功能分析
    3.8 94份烟草材料的SNP遗传多样性分析
        3.8.1 SNP标记的多态性分析
        3.8.2 94份烟草材料的聚类分析
        3.8.3 DNA指纹图谱的构建
4 讨论与结论
    4.1 讨论
        4.1.1 PCR体系对扩增产物的影响
        4.1.2 引物3’端不同错配方式对PCR扩增产物的影响
        4.1.3 SNP标记检测方法的选择
        4.1.4 基于转录组开发SNP标记
        4.1.5 SNP标记的遗传多样性分析
        4.1.6 SNP指纹图谱构建
        4.1.7 SNP与生物学性状的关系
    4.2 结论
参考文献
致谢
附录 Ⅰ:46对AS-PCR引物序列信息
附录 Ⅱ:11组KASP多态性引物序列信息
附录 Ⅲ:16组多态性SNP引物



本文编号：3824031