马铃薯原生质体培养再生及利用CRISPR/Cas9瞬时转化的研究

发布时间：2023-05-31 00:11

　　马铃薯是我国重要的粮食作物。由于马铃薯遗传背景复杂、自交不亲和等特性,新品种培育进程缓慢,鲜食、加工专用的高品质马铃薯品种匮乏。利用生物技术手段对作物进行改造,能够有效缩短育种进程。原生质体瞬时表达系统能够避免外源基因在植物基因组上的整合,可以通过后期筛选获得具有目的性状且无外源基因整合的新种质材料。本研究旨在建立一套用于CRISPR/Cas9转化的高效马铃薯原生质体制备、转化再生体系,为马铃薯遗传改良和新种质资源创造提供技术支撑。以马铃薯栽培种大西洋为材料,针对原生质体制备、转化及再生两个关键环节,研究酶解液浓度、时间、渗透压、外源激素和起始密度等关键因素,建立并优化体系。选取文献报道的StGBSS基因外显子9上20 bp序列(GBSS9)为靶位点,构建pCAMBIA2300-GBSS载体。利用CRISPR/Cas9编辑技术在叶肉原生质体进行瞬时转化。主要研究结果如下:1.对分离条件进行了优化,初步确定纤维素酶浓度为0.7%,渗透压为0.4 M甘露醇浓度,酶解时间8-9 h,为原生质体分离的最佳条件。2.对培养条件进行优化,发现外源激素2,4-D的浓度为2 mg/L、起始密度为0.5...

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
一.前言
    1.1 马铃薯育种现状及存在的问题
        1.1.1 我国马铃薯育种现状
        1.1.2 马铃薯品种传统选育技术存在的问题
    1.2 植物原生质体在遗传转化中的应用及优势
        1.2.1 植物原生质体分离与再生的影响因素
        1.2.2 原生质体在育种方面的应用
        1.2.3 原生质体转化体系对马铃薯新品种培育的重要作用和意义
    1.3 基因编辑技术在作物育种中的应用
        1.3.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术
        1.3.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在作物中的应用及存在的问题
        1.3.3 CRISPR/Cas9基因编辑对马铃薯新品种培育的重要作用和意义
    1.4 研究目的及意义
二.实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 载体
    2.2 试剂与仪器
    2.3 研究内容
    2.4 实验方法
        2.4.1 马铃薯原生质体制备条件优化
        2.4.2 马铃薯原生质体培养条件优化及再生
        2.4.3 载体的构建及马铃薯原生质体转化
        2.4.4 转化株的再生与鉴定
三.实验结果与讨论
    3.1 马铃薯原生质体制备条件优化
        3.1.1 酶解液最适浓度的筛选
        3.1.2 酶解时间对原生质体分离的影响
        3.1.3 渗透压对原生质体分离的影响
    3.2 马铃薯原生质体培养条件优化
        3.2.1 外源激素(2,4-D)浓度对原生质体分裂的影响
        3.2.2 培养起始密度对原生质体分裂的影响
        3.2.3 原生质体的分裂
        3.2.4 原生质体的再生培养
    3.3 CRISPR/Cas9瞬时转化及植株再生鉴定
        3.3.1 载体构建
        3.3.2 原生质体的转化及再生
        3.3.3 转化株的鉴定
四.全文总结
参考文献
附录1
附录2
附录3
致谢



本文编号：3825305