茶树CCoAOMT基因的克

发布时间：2023-06-02 19:05

　　茶树咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是一类S-腺苷-L-甲硫氨酸甲基转移酶,主要参与木质素和甲基化EGCGs的生物合成。本研究克隆了茶树CCoAOMT基因,优化了 CCoAOMT诱导表达条件,对其酶学性质进行了研究,并采用PCR目的区域扩增结合Sanger测序的方法分析其单核苷酸多态性。主要研究结果如下:1、以金牡丹茶树品种为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出茶树CCoAOMT基因编码区全序列,并将其克隆到表达载体pET-28a中,得到重组质粒pET-CCoAOMT,将重组质粒在表达宿主菌B121(DE3)中高效表达,得到相对分子量约为28KDa的重组蛋白。重组表达菌株在IPTG浓度为0.5mM,诱导温度为37℃,诱导时间为4H时,诱导表达效果最佳。2、体外酶促反应表明,CCoAOMT重组蛋白能催化EGCG合成EGCG3”Me。结果表明,该酶的最适反应温度为37℃,最适pH为4,以EGCG为反应底物,最佳浓度为 0.05mmol/LEGCG。3、本研究以茶树GAPDH为内参基因,对不同茶树品种中CCoAOMT基因表达进行了比较分析。结果表明,CCoAOMT基因在肉桂、迎...

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 茶树儿茶素的研究进展
    1.2 甲基化EGCG的研究进展
    1.3 茶树咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的研究进展
    1.4 单核苷酸多态性研究现状
    1.5 茶树单核苷酸多态性研究现状
    1.6 研究目的及意义
    1.7 研究内容
第二章 茶树CCoAOMT基因克隆及原核表达
    2.1 材料与方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 茶树鲜叶RNA提取
        2.2.2 CCoAOMT基因PCR克隆
        2.2.3 CCoAOMT基因原核表达
        2.2.4 CCoAOMT重组蛋白纯化
    2.3 小结与讨论
第三章 茶树CCoAOMT基因功能鉴定
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 结果与分析
        3.2.1 CCoAOMT酶促反应
        3.2.2 CCoAOMT酶促反应最适反应底物EGCG浓度
        3.2.3 CCoAOMT酶促反应最适温度
        3.2.4 CCoAOMT酶促反应最适PH
    3.3 小结与讨论
第四章 不同茶树品种中CCoAOMT基因表达分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 甲基化儿茶素在不同品种中变化规律
        4.2.2 不同茶树品种real-timePCR分析
    4.3 小结与讨论
第五章 茶树CCoAOMT基因的单核苷酸多态性分析
    5.1 材料和方法
        5.1.1 材料、试剂与仪器
        5.1.2 方法
    5.2 结果与分析
        5.2.1 CCoAOMT基因外显子的SNPs分析
        5.2.2 发生酶切位点变异的外显子SNPs
        5.2.3 导致氨基酸变异的外显子SNPs
        5.2.4 外显子SNPs变异类型分析
        5.2.5 茶树CCoAOMT基因内含子多样性情况
    5.3 小结与讨论
第六章 总结与展望
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3827858