黑果枸杞花色苷和原花青素生物合成关键酶基因的克隆和表达分析

发布时间：2023-07-29 07:08

　　黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)为茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium L.)多年生灌木,主要分布于我国西北地区。其成熟的果实中富含花色苷和原花青素等多种具有抗氧化活性的有效成分,为少数民族常用药。但目前对黑果枸杞活性成分的生物合成途径研究较少,有关生长过程中有效成分的积累与动态变化规律尚不明确。鉴于此,本研究以不同生长时期的黑果枸杞果实为研究材料,采用PCR克隆获得了控制花色苷及原花青素生物合成的关键酶基因,一方面从化学成分含量和关键酶基因的表达量来研究活性成分的积累与动态变化规律,寻找有效成分的最大积累期,进而确定黑果枸杞浆果的最佳采收期;另一方面将关键酶基因构建到病毒诱导的瞬时表达载体上,并观察异源表达此类基因的烟草中有效成分变化情况。主要实验结果如下:1.利用高保真酶扩增获得控制黑果枸杞果实中花色苷和原花青素合成的关键酶基因—LrDFR、LrANS、LrLAR和LrANR,其序列全长分别为1140、1251、1002和1017 bp,经预测发现其分别编码大小为379、416、333和338 aa的蛋白质,均具有相应蛋白家族的特征位点及结构域...

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
第一章 前言
    1.1 黑果枸杞的研究概述
        1.1.1 黑果枸杞的抗逆性与繁殖
        1.1.2 活性成分研究
    1.2 花色苷与原花青素的次生代谢研究
        1.2.1 花色苷与原花青素的生物合成途径
        1.2.2 花色苷及原花青素代谢通路下游关键酶及其基因的研究
    1.3 瞬时表达技术与植物病毒载体的研究进展
        1.3.1 植物病毒载体的特点及构建
        1.3.2 马铃薯X病毒表达载体
    1.4 研究目的及意义
第二章 黑果枸杞花色苷及原花青素生物合成关键酶基因的克隆及相关分析
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 试剂及缓冲液
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 方法
        2.2.1 黑果枸杞RNA提取及cDNA合成
        2.2.2 关键酶基因PCR扩增
        2.2.3 PCR产物的纯化
        2.2.4 连接、转化及重组鉴定
        2.2.5 基因及编码蛋白的生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 LrDFR、LrANS、LrLAR和LrANR基因序列分析
        2.3.2 LrDFR、LrANS、LrLAR和LrANR蛋白结构及性质分析
    2.4 小结与讨论
        2.4.1 核苷酸及氨基酸序列的差异性
        2.4.2 酶蛋白结构域及活性位点的保守性
第三章 黑果枸杞中花青素及原花青素积累规律研究
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 试剂及缓冲液
        3.1.3 主要仪器设备
    3.2 方法
        3.2.1 黑果枸杞生长过程中花色苷的积累变化
        3.2.2 黑果枸杞生长过程中原花青素的积累变化
        3.2.3 黑果枸杞生长过程中关键酶基因的表达分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 黑果枸杞生长过程中花色苷的代谢变化
        3.3.2 黑果枸杞生长过程中原花青素的代谢变化
        3.3.3 不同时期关键酶基因的表达分析
    3.4 小结与讨论
        3.4.1 黑果枸杞中花色苷的积累代谢规律
        3.4.2 黑果枸杞中原花青素的积累代谢规律
第四章 关键酶基因的病毒载体构建及其在烟草中的瞬时表达研究
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料和菌种
        4.1.2 试剂及缓冲液
        4.1.3 主要仪器设备
    4.2 方法
        4.2.1 LrANS、LrLAR及LrANR基因的pMD18T载体质粒提取
        4.2.2 瞬时表达载体的构建
        4.2.3 重组质粒导入农杆菌
        4.2.4 农杆菌浸染普通烟
        4.2.5 瞬时表达烟草的花色苷及原花青素的含量测定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 瞬时表达载体的构建结果
        4.3.2 转化烟草中花色苷与原花青素的含量变化
    4.4 小结与讨论
        4.4.1 LrANS-pGR107的瞬时表达分析
        4.4.2 LrLAR-pGR107和LrANR-pGR107的瞬时表达分析
第五章 全文结论
参考文献
Abstract
附录A: 本文所用主要缩写词及中英文对照
附录B: 本文所用的化学试剂和缓冲液的配制
附录C: 本文扩增获得的酶基因序列
致谢



本文编号：3837782