利用CRISPR/Cas9技术创建甘蓝型油菜染色体联会紊乱突变体
发布时间：2023-08-07 17:55
减数分裂是有性生殖生物世代交替的关键环节,在此过程中同源染色体完成识别、配对、联会、非姊妹染色单体间的片段交换及分离等一系列重要事件。配对的同源染色体间会形成联会复合体,交换于此完成。模式植物拟南芥中,AtZYP1是形成联会复合体的横向细丝蛋白。zyp1突变体减数分裂中,联会复合体不能形成,同源染色体间的交换数量显著减少,但是部分同源染色体间的交换增加。甘蓝型油菜(Brassica napus L)为异源四倍体,基因组复杂,且由于缺少相关突变体,减数分裂遗传调控方面的研究较少。本研究中,我们利用CRISPR技术,对甘蓝型油菜ZYP1的四个同源基因进行编辑,获得突变体材料,研究其在甘蓝型油菜减数分裂中的功能。利用这些突变体为中间材料,也可能促进油菜染色体与近缘种染色体间的交换,从而将近缘种优异基因导入油菜中。主要研究结果如下:(1)利用拟南芥AtZYP1序列进行同源比对,在白菜、甘蓝与甘蓝型油菜中分别发现2、2与4个同源基因。以这些基因序列为基础,构建了同时靶向甘蓝型油菜BnZYP1四个拷贝的双靶点CRISPR/Cas9载体,利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜Westar,T0
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词
1 前言
1.1 同源重组分子机制
1.1.1 减数分裂的一般过程
1.1.2 双链断裂的产生与修复
1.1.3 同源染色体的识别、配对与联会复合体形成
1.1.4 交换的形成
1.2 联会复合体的组分及其功能
1.2.1 联会复合体主要蛋白组分
1.2.2 联会复合体的功能
1.2.3 ZYP影响同源/部分同源染色体配对与交换发生
1.3 减数分裂的遗传调控及其在育种中的应用
1.3.1 减数分裂进程的改变
1.3.2 交换频率与位置的遗传调控
1.4 甘蓝型油菜减数分裂的相关研究
1.4.1 甘蓝型油菜的起源与进化
1.4.2 甘蓝型油菜减数分裂相关基因的定位与克隆
1.5 CRISPR/Cas技术的发展及其应用
1.5.1 CRISPR/Cas发现及发展
1.5.2 CRISPR/Cas的类型及作用原理
1.5.3 CRISPR/Cas9 在遗传育种中的应用
1.6 本研究的目的和意义
2.实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体和菌株
2.1.3 实验常用试剂与耗材
2.1.4 引物合成与PCR产物测序
2.1.5 目的基因序列获取及分析
2.1.6 双靶点CRISPR/Cas9 载体的构建
2.1.7 电转法转化农杆菌感受态GV3101
2.1.8 农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化
2.1.9 转基因植株的检测
2.1.10 转基因植株靶位点编辑检测
2.1.11 普通细胞学分析
3.结果与分析
3.1 Bn ZYP1 不同拷贝间的进化关系
3.2 Bn ZYP1 不同拷贝基因结构与在氨基酸水平的变异
3.3 靶点的选择与载体构建
3.3.1 BnZYP1 基因sgRNA的选择
3.3.2 CRISPR/Cas9 载体构建
3.4 转基因T0 代植株阳性鉴定
3.5 T0代BnZYP1 编辑位点检测
3.5.1 测序特异性引物的设计
3.5.2 T0代Bn ZYP1 突变类型
3.5.3 T0 代突变体Bn ZYP1 氨基酸变化
3.6 突变的遗传分析
3.6.1 T1 代转基因植株核苷酸变化
3.6.2 T1代Bn ZYP1 转基因植株氨基酸变化
3.7 Bnzyp1 突变植株表型
3.7.1 雄蕊发育
3.7.2 花粉可染性
3.7.3 减数分裂染色体行为
4.讨论
4.1 利用CRISPR/Cas9 编辑多拷贝基因
4.2 CRISPR/Cas9 在甘蓝型油菜中的突变特点
4.3 Bn ZYP1 在甘蓝型油菜减数分裂中的作用
参考文献
附录
附录1 构建载体引物
附录2 转基因植株PCR初步检测引物
附录3 阳性植株测序所用引物
附录4 PAGE检测所用引物
附录5 阳性植株测序峰图
附录6 培养基的配置
附录7 CTAB法提取DNA
致谢
本文编号：3840082
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词
1 前言
1.1 同源重组分子机制
1.1.1 减数分裂的一般过程
1.1.2 双链断裂的产生与修复
1.1.3 同源染色体的识别、配对与联会复合体形成
1.1.4 交换的形成
1.2 联会复合体的组分及其功能
1.2.1 联会复合体主要蛋白组分
1.2.2 联会复合体的功能
1.2.3 ZYP影响同源/部分同源染色体配对与交换发生
1.3 减数分裂的遗传调控及其在育种中的应用
1.3.1 减数分裂进程的改变
1.3.2 交换频率与位置的遗传调控
1.4 甘蓝型油菜减数分裂的相关研究
1.4.1 甘蓝型油菜的起源与进化
1.4.2 甘蓝型油菜减数分裂相关基因的定位与克隆
1.5 CRISPR/Cas技术的发展及其应用
1.5.1 CRISPR/Cas发现及发展
1.5.2 CRISPR/Cas的类型及作用原理
1.5.3 CRISPR/Cas9 在遗传育种中的应用
1.6 本研究的目的和意义
2.实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体和菌株
2.1.3 实验常用试剂与耗材
2.1.4 引物合成与PCR产物测序
2.1.5 目的基因序列获取及分析
2.1.6 双靶点CRISPR/Cas9 载体的构建
2.1.7 电转法转化农杆菌感受态GV3101
2.1.8 农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化
2.1.9 转基因植株的检测
2.1.10 转基因植株靶位点编辑检测
2.1.11 普通细胞学分析
3.结果与分析
3.1 Bn ZYP1 不同拷贝间的进化关系
3.2 Bn ZYP1 不同拷贝基因结构与在氨基酸水平的变异
3.3 靶点的选择与载体构建
3.3.1 BnZYP1 基因sgRNA的选择
3.3.2 CRISPR/Cas9 载体构建
3.4 转基因T0 代植株阳性鉴定
3.5 T0代BnZYP1 编辑位点检测
3.5.1 测序特异性引物的设计
3.5.2 T0代Bn ZYP1 突变类型
3.5.3 T0 代突变体Bn ZYP1 氨基酸变化
3.6 突变的遗传分析
3.6.1 T1 代转基因植株核苷酸变化
3.6.2 T1代Bn ZYP1 转基因植株氨基酸变化
3.7 Bnzyp1 突变植株表型
3.7.1 雄蕊发育
3.7.2 花粉可染性
3.7.3 减数分裂染色体行为
4.讨论
4.1 利用CRISPR/Cas9 编辑多拷贝基因
4.2 CRISPR/Cas9 在甘蓝型油菜中的突变特点
4.3 Bn ZYP1 在甘蓝型油菜减数分裂中的作用
参考文献
附录
附录1 构建载体引物
附录2 转基因植株PCR初步检测引物
附录3 阳性植株测序所用引物
附录4 PAGE检测所用引物
附录5 阳性植株测序峰图
附录6 培养基的配置
附录7 CTAB法提取DNA
致谢
本文编号：3840082
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/3840082.html
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