基于高通量CRISPR/Cas9创制大豆结瘤固氮突变体

发布时间：2024-04-13 14:27

　　大豆(Glycine max)是我国重要的油料和经济作物,是人类重要的植物蛋白和油分的来源,在食品工业和农业生产中有着重要地位。大豆作为豆科作物,可通过结瘤进行生物固氮。高效利用共生固氮对农业的可持续发展至关重要,有助于提高大豆的生产力和竞争优势。但大豆自身古四倍体基因组的冗余性,使得大豆结瘤固氮调控基因的挖掘工作相对滞后。本研究通过同源性和表达谱的分析,筛选到18个可能参与大豆结瘤调控途径的基因,借助高通量CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因进行定点敲除。共设计20个sg RNA靶向18个目的基因,经过4次大豆的稳定转化得到覆盖所有20个sg RNA载体在内的120棵阳性转基因植株。T₀代以sg RNA统计群体的编辑效率,其平均编辑效率为32.7%。以目的基因统计整体基因编辑效率为45.8%。20个株系中,T₁代有8个株系发生基因编辑,而在T₀代仅有6个株系。T₁代基因编辑效率在T₀代基础上有所提高。从构建的“高效结瘤”突变体库中我们筛选到与结瘤自调控途径相关的“高效结瘤...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 引言
    1.2 豆科植物的共生固氮与根瘤发育
        1.2.1 根瘤形成的分子机制
        1.2.2 豆科植物根瘤的结瘤自调控机制
    1.3 植物CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究进展
    1.4 CRISPR/Cas9基因编辑技术在大豆中的研究进展
    1.5 高通量CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究进展
    1.6 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料和生长条件
        2.1.2 实验菌株及载体
        2.1.3 试剂与药品
        2.1.4 常用仪器
        2.1.5 培养基配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 高通量CRISPR/Cas9基因编辑载体构建
        2.2.2 大豆叶片DNA快速提取方法
        2.2.3 SSP(Specific sg RNA PCR)鉴定转基因阳性植株sg RNA分布
        2.2.4 Sanger测序方法判定基因编辑方式
        2.2.5 大豆水培
        2.2.6 乙炔还原法测固氮酶活
        2.2.7 大豆根瘤RNA提取及基因表达量检测
3 结果与分析
    3.1 大豆中目标基因的选择
    3.2 候选基因sg RNA的设计及混池转化策略
    3.3 T0代阳性植株中sg RNA分布与基因编辑效率统计
        3.3.1 T0代阳性植株的sg RNA分布
        3.3.2 T0代阳性植株的基因突变情况
    3.4 T1代基因编辑效率及转基因元件的遗传分离统计
    3.5 纯合突变体的筛选鉴定和基因型分析
        3.5.1 突变体gmric1/ric2的基因型分析
        3.5.2 突变体gmrdn1-1/rdn1-2/rdn1-3 的基因型分析
    3.6 纯合突变体的表型鉴定与分析
        3.6.1 gmric1/ric2突变体表型鉴定与分析
        3.6.2 gmrdn1-1/rdn1-2/rdn1-3 突变体表型鉴定与分析
4 讨论
    4.1 高通量CRISPR/Cas9基因编辑载体可提高基因编辑效率
    4.2 gmric1/ric2和gmrdn1-1/rdn1-2/rdn1-3 突变体的应用
    4.3 展望
5 结论
参考文献
附录A 人工合成引物列表
附录B 库A转基因植株编辑情况统计
攻读学位期间的学术论文与研究成果
致谢



本文编号：3953182