截短侧耳素类抗生素在鲫鱼体内的识别鉴定与富集释放规律研究

发布时间：2020-03-31 11:28

【摘要】：截短侧耳素是一类广谱抗生素,是由高等真菌产生的三环二萜烯类化合物。而通过截短侧耳素类前体合成的抗生素主要包括沃尼妙林(Valnemulin,VLM)及泰妙菌素(Tiamulin,TML)等,以上抗生素的结构上有五元环、八元环上的羰基、C-14位上的酰基及C-11位上的羟基等基团。沃尼妙林主要是通过在家禽、水产品等体内与病原微生物核糖体的50S亚基相结合,从而与病原体23SrRNA的V区位作用,阻止病原体的肽基转移酶在CCA-末端的正确定位,进而抑制蛋白质的生成,达到使病原体死亡的目的。泰妙菌素主要对支原体、猪密螺旋型痢疾、脲原体感染、猪放线菌性胸膜肺炎、肠道螺旋体病、猪肺炎霉形体等具有良好效果。沃尼妙林的毒性低,无致癌、致畸、致突变及繁殖毒性,且无免疫系统损害。因截短侧耳素类抗生素能够有效作用于肠道螺旋体、支原体及革兰氏阳性菌,所以目前被广泛用于鱼类等水产品及猪、牛等陆地家禽疾病的预防与治疗。本文的受试动物为鲫鱼(Carassius auratus)。在实验条件下建立了适用于鱼体内沃尼妙林和泰妙菌素残留的检测方法,并进一步探究了这两种截短侧耳素类抗生素在鲫鱼体内富集与释放的规律。主要研究内容如下:1.通过对提取试剂的比较,净化条件的优化,色谱条件以及质谱条件的优化,建立了适用于鱼体内沃尼妙林和泰妙菌素残留的检测方法。鲫鱼各组织样品用2%甲酸-乙腈超声提取后,经Oasis MCX SPE小柱净化,采用超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定,沃尼妙林和泰妙菌素分别采用外标法定量,内标法定量。以含有0.05%甲酸的乙酸铵水溶液作为流动相,梯度洗脱分离,电喷雾正离子多反应监测模式监测。结果表明,这两种截短侧耳素类抗生素在5~1000 ng/mL内呈现良好的线性关系。沃尼妙林和泰妙菌素的检出限和定量限分别为0.03μg/kg和0.1μg/kg。在0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μg/kg五种添加水平条件下,成年鲫鱼肌肉中沃尼妙林和泰妙菌素的平均回收率为96.72%~113.78%,相对标准偏差为1.02%~3.68%;肝脏中沃尼妙林和泰妙菌素的平均回收率为99.23%~115.43%,相对标准偏差为2.60%~7.06%;肠中沃尼妙林和泰妙菌素的平均回收率为80.35%~111.41%,相对标准偏差为1.68%~7.24%;批间相对标准偏差为2.26%~9.10%,均小于10.0%,符合实验的要求。本方法操作简单,耗时少,重复性好,灵敏度高,实样检测结果表明该方法适合鲫鱼体内沃尼妙林和泰妙菌素的实际测定。2.应用腹腔注射的给药方式,分别在不同的时间节点取出鲫鱼各组织,经超高效液相色谱串联四级杆及飞行时间质谱(UPLC/Q TOF MS)分析,结合各代谢物的相对分子质量以及相关文献,确定泰妙菌素在鲫鱼体内产生五种代谢物,分别是M1(510.2908,C_(28)H_(48)NO_5S~+)、M2(510.2908,C_(28)H_(48)NO_5S~+)、M3(466.2750,C_(26)H_(44)NO_4S~+)、M4(482.2663,C_(26)H_(44)NO_5S~+)和M5(482.2663,C_(26)H_(44)NO_5S~+)。M1和M2是同分异构体;M4和M5也是同分异构体,但同时也是M3的代谢物,是泰妙菌素的二级代谢产物。沃尼妙林在鲫鱼体内产生三种代谢物V1(581.3182,C_(31)H_(52)N_2O_6S)、V2(581.3182,C_(31)H_(52)N_2O_6S)和V3(597.0903,C_(31)H_(52)N_2O_7S),V1和V2是同分异构体;因文献以及实验仪器的局限性,具体结构还未确定。沃尼妙林和泰妙菌素的靶器官均为肝脏,经胆囊排出体外。代谢物在其他各组织中也都存在。沃尼妙林的三种代谢物更多的出现在胆囊和皮肤中。除此之外,沃尼妙林和泰妙菌素在不同物种之间产生的代谢物也不同。3.应用药浴方法,探究沃尼妙林和泰妙菌素以及两者的代谢物在鲫鱼苗体内的富集和代谢规律。结果表明,泰妙菌素主要的代谢产为M1(8α-OH-TML)、M3(N-deethly-TML)和M4(8α-OH-N-deethly-TML),沃尼妙林主要的代谢产物为V1(8α-OH-VLM或2β-OH-VLM)和V2(2β-OH-VLM或8α-OH-VLM),主要代谢途径是母核羟基化。由此断定,泰妙菌素在鲫鱼体内的潜在标志残留物是8α-OH-TML、N-deethly-TML和8α-OH-N-deethly-TML;沃尼妙林在鲫鱼体内的潜在标志残留物是8α-OH-VLM和2β-OH-VLM。在富集阶段,沃尼妙林和泰妙菌素的含量都是呈现锯齿状升高,在饱和阶段呈现波动性平稳,在最后的释放阶段呈现下降的趋势。整个过程呈现先上升后下降的趋势。沃尼妙林和泰妙菌素在鲫鱼苗体内的生物富集系数分别为1.23,3.01,泰妙菌素的生物富集系数大于沃尼妙林的生物富集系数,泰妙菌素的富集速率更快一些,但是两种物质在2天之内都能达到饱和。沃尼妙林和泰妙菌素在鲫鱼体内的半衰期分别为4.28天,3.74天,泰妙菌素的消除速率要快于沃尼妙林。且两种药物净化的第二周,都没有消除完全;腹腔注射两种药物,其在各组织中的药物基本都能在一天之内消除完全。结果表明,不同种给药途径,两种药物在体内的代谢规律不一样,腹腔注射的给药途径要比药浴第七天停药后代谢快得多。
【图文】：

图 1-1 沃尼妙林结构式Fig. 1.1 The structure of valnemulin沙星、泰乐菌素等药物，更不易产葡萄球菌、鸡败血霉形体、牛霉形疾短螺旋体等均有较好的作用[12,13疾、腹泻等疾病具有良好防治作用理主要是通过在家禽、水产品等体病原体 23SrRNA 的 V 区位作用，，进而抑制蛋白质的生成，，达到使林是通过结合病原体的 23 位 S 基，在列腺素 E2、一氧化氮、肿瘤坏死因化酶 2 等，引起白细胞介素-6 的表氨基末端激酶等的正常作用，从而尼妙林的毒性低，无致癌、致畸、、雄性小鼠、雌性小鼠的半数致死

图 1-2 泰妙菌素结构式Fig. 1.2 The structure of tiamulin、猪密螺旋型痢疾、脲原体感染体、鸡败血霉形体、金黄色葡萄节炎等具有良好效果。其结构上基及 C-14 位上的酰基对其抗菌确规定泰妙菌素及其代谢物质别为 100 μg/kg、500 μg/kg，而 8量分别为 100 μg/kg、1000 μg物脂肪、肝脏、肌肉中的最高残留
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S948

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本文编号：2609017